FACS Antibodies

Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) ist eine spezielle Art der Durchflusszytometrie. Dabei wird ein heterogenes Gemisch biologischer Zellen auf der Grundlage der spezifischen Lichtstreuungs- und Fluoreszenzeigenschaften jeder Zelle und der daran gebundenen Antikörper zellweise in zwei oder mehr Behälter sortiert.

Wie wählt man Antikörper für FACS-Experimente aus?

Dieser Leitfaden führt Sie zu präzisen Ergebnissen in der Durchflusszytometrie. In einem Durchflusszytometrie-Experiment spielen Antikörper eine entscheidende Rolle. Antikörper, die mit fluoreszierenden Markern konjugiert sind, können unsere spezifischen Zellen von Interesse identifizieren und die Menge unseres Ziels auf der Zelle quantifizieren.

Es gibt verschiedene Methoden zur Herstellung von Antikörpern, jede mit ihren Vor- und Nachteilen. Die Antikörper unterscheiden sich in der Bindungsqualität und letztlich in der Färbung der Zellen. Bei polyklonalen Antikörpern ist die Wahrscheinlichkeit größer, dass sie mit anderen Proteinen als dem Zielprotein kreuzreagieren, und sie sind anfällig für Schwankungen zwischen den Chargen. Monoklonale Antikörper, insbesondere rekombinante Antikörper, sind konsistent und reproduzierbar. Insbesondere binden monoklonale Antikörper an das gleiche Epitop, was sie ideal für Durchflusszytometrie-Experimente macht. Sie verringern das Risiko einer Off-Target-Bindung und bieten die höchstmögliche Reproduzierbarkeit von Charge zu Charge.

Rekombinante Antikörper sind ebenfalls eine ernstzunehmende Alternative. Da sie gentechnisch hergestellt werden, ist es möglich, den Fc-Teil des Antikörpers zu verändern und so die Bindung an die Fc-Rezeptoren auf den Zielzellen zu reduzieren oder sogar zu eliminieren. Aber Vorsicht, nicht alle gewünschten Ziele werden derzeit von rekombinanten Antikörpern abgedeckt.

Wenn wir unseren Pool an möglichen Antikörpern auf monoklonale Antikörper eingrenzen, müssen wir noch zwischen verschiedenen Klonlinien unterscheiden. Not all are suited for flow cytometry and some even might recognize the wrong epitope, such as a product targeting an intracellular epitope when the intention is to avoid permeabilizing the cells.

Eine letzte Frage, die sich stellt, ist, ob ein direkt konjugierter oder ein nicht konjugierter Antikörper verwendet werden soll. Direkt konjugierte Antikörper vereinfachen das Testprotokoll und verringern die Gefahr von Fehlern bei der Probenvorbereitung. Insbesondere für Multiplexing-Ansätze sind sie das geeignetere Format - sie erlauben die gleichzeitige Verwendung mehrerer Antikörper, die in derselben Spezies gezüchtet wurden, und ermöglichen eine höhere experimentelle Komplexität. Sollte die gewünschte Antikörper-Fluorophor-Kombination jedoch nicht verfügbar sein, können als Ersatz auch primäre Antikörper in Kombination mit konjugierten sekundären Antikörpern verwendet werden.

Additional Reading

Fluoreszenzkonjugierte Antikörper für FACS

Fluophore	Excitation Peak (nm)	Emission Peak (nm)	Emission Color
DyLight 405	400	421
Alexa Fluor 405	401	421
DyLight 350	352	435
Alexa Fluor 350	346	442
Atto 390	390	470
Alexa Fluor 488	493	519
FITC	492	520
Atto 488	501	523
Cy3	550	570
Alexa Fluor 594	550	570
Phycoerythrin (PE)	565	578
Atto 565	563	592
Atto 594	591	616
Atto 633	629	657
APC	650	661
Alexa Fluor 647	651	667
Cy5	650	670
PerCp	490	675
Atto 655	633	684
Cy5.5	675	694
Atto 680	684	702
Alexa Fluor 700	702	723
Cy7	778	754
DyLight 800	771	796
Alexa Fluor 790	784	814

Zelloberflächenmarker

Bei der Suche nach FACS-Antikörpern kommen einem automatisch Zelloberflächenmarker in den Sinn. Die Antikörper sind in der Regel gegen bestimmte Oberflächenproteine gerichtet (z.B. Proteine der CD-Klassifikation; CD = Cluster of Differentiation). Nach der Markierung kann dann auch eine Sortierung nach diesen Merkmalen erfolgen.

FACS-Antikörper für die Immuno-Onkologie

Die Immunphänotypisierung ist eine Technik zur Untersuchung der von Zellen exprimierten Proteine. Ein Beispiel ist der Nachweis von Tumormarkern, wie bei der Diagnose von Leukämie. Dazu werden die weißen Blutkörperchen mit Antikörpern markiert, die gegen Oberflächenproteine auf ihrer Membran gerichtet sind. Durch die Auswahl geeigneter Antikörper, z. B. CD19, CD10, CD45 oder HLA-DR, kann die Differenzierung der leukämischen Zellen genau bestimmt werden. Die markierten Zellen werden dann in einem Durchflusszytometer verarbeitet. Das gesamte Verfahren kann mit Zellen aus dem Blut, dem Knochenmark oder der Rückenmarksflüssigkeit durchgeführt werden.

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