RNA Therapeutika

In den vergangenen Jahrzehnten haben RNA-basierte Therapeutika an Bedeutung gewonnen. Insbesondere bei Erkrankungen mit genetischen Ursachen bieten Oligonukleotidketten einen vielversprechenden Therapieansatz – häufig sogar den ersten überhaupt. Derzeit werden hauptsächlich zwei Ansätze zur gezielten Beeinflussung von RNA eingesetzt: doppelsträngige RNA-vermittelte Interferenz (RNAi) und Antisense-Oligonukleotide (ASO). Beide Ansätze befinden sich derzeit in klinischen Studien zur gezielten Modulation von RNAs, die an verschiedenen Erkrankungen beteiligt sind, darunter Krebs und neurodegenerative Erkrankungen. antibodies-online unterstützt Sie bei der Entwicklung RNA-basierter Therapeutika.

Herausforderungen in der therapeutischen Produktion

Aufgrund ihrer Sequenzspezifität kann eine Oligonukleotid-Therapie prinzipiell gegen jede mRNA und damit gegen jede Erkrankung eingesetzt werden, die durch Gen-Knockdown behandelbar ist. Die Anwendung von Oligos bringt jedoch auch potenzielle Hürden mit sich, etwa den vergleichsweise schnellen Abbau von RNA im Blutkreislauf und die gezielte Aufnahme des Therapeutikums – vorzugsweise in erkrankte Zellen oder Gewebe eines Organismus.

Die Weiterentwicklung der Medizinalchemie von Oligonukleotiden war entscheidend für die stetig verbesserte klinische Leistungsfähigkeit von ASOs. ASOs sind oligomer und bestehen aus Nukleotidanaloga. Da ASOs so konzipiert werden können, dass sie über verschiedene Mechanismen nach der RNA-Bindung wirken, wurden zahlreiche Designs evaluiert. Mit der Identifizierung neuer molekularer Wirkmechanismen sowie neuen Erkenntnissen zu den molekularen Mechanismen von Verteilung, zellulärer Aufnahme und subzellulärer Verteilung sowie verschiedenen Toxizitäten werden die Designs zunehmend komplexer.

Medizinalchemie von Oligonukleotiden: Modifikationen und ihre Vorteile

Die Phosphorothioat-(PS-)Modifikation wird breit in allen wichtigen ASO-Klassen und in allen chemisch modifizierten siRNAs eingesetzt. Der Austausch eines nicht verbrückenden Sauerstoffatoms durch Schwefel verändert die physikochemischen Eigenschaften des Phosphats in wesentlicher Weise. Da das Schwefelatom doppelt so groß ist wie das Sauerstoffatom, unterscheiden sich Ladungsverteilung, Bindungswinkel und Streckung von PS-Bindungen erheblich von Phosphodiester-(PO-)Bindungen. Die Schwefelsubstitution verteilt die Ladung und macht das Phosphat „lipophiler“, wodurch die Bindung an Proteine erleichtert wird. Im Allgemeinen sind für Proteine, die PS-Einheiten zur Bindung von ASOs benötigen, mindestens 10 solcher Modifikationen erforderlich, um relevante Proteininteraktionen zu unterstützen. Die durch PS-Substitutionen ermöglichte verstärkte Proteinbindung ist entscheidend, da die Proteinbindung von einzelsträngigen PS-ASOs eine zentrale Rolle bei Absorption, Verteilung, zellulärer Aufnahme, intrazellulärer Verteilung, Aktivität und Toxizität von PS-ASOs spielt.

Modifikationen an der 2′-Position des Riboserings werden häufig eingesetzt, um die Stabilität von Oligonukleotiden zu erhöhen und die Resistenz gegenüber Nukleaseaktivität in vivo zu verbessern. RNA-Oligonukleotide, die unter Verwendung von 2′-MOE-Modifikationen, sogenannten Phosphoramiditen, synthetisiert werden, haben sich als nukleaseresistenter erwiesen, weisen eine geringere Toxizität auf und zeigen leicht erhöhte Hybridisierungsaffinitäten. Dadurch eignen sie sich gut für therapeutische in vivo-Anwendungen wie ASO, siRNA und Aptamere. 2′-O-Methylnukleotide bieten aufgrund ihrer kinetischen Eigenschaften und Schmelzeigenschaften Vorteile. 2′-O-Methyl-Oligoribonukleotid-Sonden binden schneller an RNA-Zielmoleküle und weisen bei verschiedenen Sondenlängen deutlich höhere Schmelztemperaturen (Tm) auf. Aufgrund ihrer stark erhöhten Tm bei Bindung an RNA können 2′-O-Methyl-Oligoribonukleotid-Sonden effizient an doppelsträngige Regionen strukturierter RNA-Moleküle binden. Die erhöhte Tm, schnellere Hybridisierungskinetik, Fähigkeit zur Bindung an strukturierte Zielmoleküle und erhöhte Spezifität von 2′-O-Methyl-Oligoribonukleotid-Sonden machen sie den entsprechenden 2′-Desoxy-Oligoribonukleotiden für den Einsatz in Assays zum Nachweis von RNA-Zielmolekülen überlegen.

2′-MOE-modifizierte Oligonukleotide haben gezeigt, dass sie eine Gewebeverteilung aufweisen, die der von Phosphorothioat-Oligodesoxynukleotiden (PS ODNs) ähnelt, und im Vergleich zu PS ODNs geringere Toxizitäten verursachen. Darüber hinaus reduziert die 2′-MOE-Substitution proinflammatorische Effekte signifikant.

Die therapeutische Nutzbarkeit des siRNA-vermittelten Gene Silencing hängt von Verbesserungen der Biostabilität, Spezifität und Verabreichung der Moleküle ab. Diese Herausforderungen können durch Modifikation von siRNA mit Locked Nucleic Acid (LNA), einem Nukleinsäureanalogon mit außergewöhnlicher Bindungsaffinität, überwunden werden. LNA bietet eine ausgezeichnete Spezifität gegenüber komplementären RNA- und DNA-Oligonukleotiden. Der Einbau von LNA erhöht die Serumhalbwertszeit von siRNAs erheblich, was eine zentrale Voraussetzung für den therapeutischen Einsatz ist. Darüber hinaus ist LNA mit der intrazellulären siRNA-Maschinerie kompatibel und kann genutzt werden, um unerwünschte sequenzbedingte Off-Target-Effekte zu reduzieren. Die bemerkenswerten Eigenschaften von LNA haben zu Anwendungen in verschiedenen Gene-Silencing-Strategien sowohl in vitro als auch in vivo geführt.

Die Nachweis-Herausforderung

Die Entwicklung und Herstellung von Oligonukleotid-Therapeutika erfordert in jeder Phase rigorose und konsistente analytische Methoden. Traditionell waren ISH-basierte Assays die primäre Methode zum Nachweis und zur Lokalisierung von Oligonukleotiden in Zellen und Geweben. ISH kann jedoch kurze therapeutische Oligonukleotidsequenzen nicht binden und nachweisen und erfordert für jeden einzelnen Kandidaten spezifische Sonden – wodurch Sondenentwicklung und Kandidatentriage zeitaufwendig und kostspielig werden.

Viele konventionelle analytische Methoden sind zudem durch Sequenzabhängigkeit, komplexes Sondendesign oder reduzierte Sensitivität für chemisch modifizierte Oligonukleotide eingeschränkt, wodurch ein ungedeckter Bedarf an robusten Alternativen entsteht.

Zuverlässiger Nachweis modifizierter Oligos: ModDetect® Panels

Die ModDetect® Panels von Rockland sind gebrauchsfertige, immunoassay-basierte Alternativen, die einen robusten Nachweis und eine zuverlässige Lokalisierung der Wirkstoffverteilung von Oligonukleotid-Therapeutika ermöglichen und so die Erhebung analytischer ADME-Daten für die regulatorische Zulassung unterstützen. Die universelle Natur sowie die einzigartige Spezifität und Sensitivität dieser Reagenzien machen spezifische Sonden überflüssig und beschleunigen die Kandidatentriage – eine kosteneffiziente Lösung mit geringem Risiko, die 9–12 Monate in der Wirkstoffentwicklung einsparen kann.

ModDetect® Panels umfassen monoklonale Antikörperreagenzien, die sequenzunabhängig gegen Nukleinsäure-Backbones oder Zucker-Modifikationen gerichtet sind, wobei jedes Panel für eine spezifische chemische Modifikation entwickelt wurde. Diese Antikörper bieten sensitive und vielseitige Werkzeuge für Visualisierung, Quantifizierung und Nachweis in etablierten Immunoassays, einschließlich ELISA, Immunzytochemie (ICC) und Immunhistochemie (IHC). ModDetect Panels sind in unkonjugierten und biotinylierten Formaten erhältlich und werden international über antibodies-online vertrieben, wodurch Forschenden außerhalb der USA ein unkomplizierter Zugang zu diesen Reagenzien ermöglicht wird.

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Verwandte Produkte und Ressourcen

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Referenzen

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