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Eine Einführung in die ELISA-Methode (Teil 1)

Einführung

Enzym Linked Immunosorbent Assays (ELISA-Testmethoden) gehören zu den häufigsten Wet-Lab-Proteomik-Analysen, die heutzutage im Einsatz sind. Der ELISA entstand aus einer älteren Assay-Anordnung, dem Radiometric Immuno-Assay. Der RIA nutzt radioaktive Reagenzien, die eine erhebliche Gefahr für die menschliche Gesundheit und Sicherheit darstellen, wenn sie unsachgemäß gehandhabt werden. Die ersten ELISA-Testmethoden wurden entwickelt, um diese Gefahr zu umgehen und eine schnelle, einfache und sichere Alternative zu schaffen. Obwohl die RIA-Testverfahren noch in manchen Fällen verwendet werden, wurden sie weitgehend durch den sichereren, technisch weniger aufwändigen ELISA ersetzt. Wie sein Vorgänger ist der ELISA eine antikörperbasierte Methode, die entwickelt wurde, um quantitativ oder qualitativ einen bestimmten Analyten in einer Probe nachzuweisen. Analyten, die durch die ELISA-Methode untersucht werden, sind häufig (aber nicht notwendigerweise) Proteine und die Probentypen können von einfachen biologischen Flüssigkeiten (z. B. Plasma, Serum, Urin, Schweiß) bis hin zu einem raffinierten Zellkulturmedium oder einem aufgereinigten rekombinanten Protein in einer Lösung reichen.

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Obwohl es viele verschiedene Arten von ELISAs gibt, ist das Grundprinzip des Assays bestechend einfach: Antikörper, die mit einem Enzym (am häufigsten eine Peroxidase) konjugiert sind, werden an einen Analyten gebunden, der auf einem soliden Träger (in der Regel eine 96-well-Mikrotiterplatte) immobilisiert wird. Die Probe wird ausgewaschen und alle ungebunden Antikörper werden ausgespült. Danach wird ein farbloses chromogenes Substrat aufgebracht und das Enzymkonjugat katalysiert eine Reaktion, die das farblose Substrat in ein dunkel gefärbtes Derivat verwandelt. Die Farbveränderung dient zur Bestätigung der Anwesenheit des Analyten in einem qualitativen Assay. In einem quantitativen Assay kann der Grad der kolorimetrischen Veränderung mit der beobachteten Veränderung, die aus einer Reihe von bekannten Konzentrationsstandards beobachtet werden kann, verglichen werden, um die Menge des vorhandenen Analyten zu schätzen.

Representative image of an ELISA after the color change reaction takes place Ein typischer abgeschlossener ELISA

Eine 96-well-Mikrotiterplatte dient als solider Träger und dient als Oberfläche für die Durchführung der ELISA-Reaktion. Ein Enzym, das an einen Antikörper konjugiert ist, verwandelt ein farbloses chemisches Substrat in ein Substrat mit einer dunklen Farbe.

Der Grad, mit welchem sich die Farbe verändert hat, wird herangezogen, um die Menge eines Analyten in der Probe zu bestimmen.

Ist ein ELISA das richtige Nachweisverfahren für mich?

Der ELISA ist bekannt als schneller, einfacher und präziser Assay, der entweder einen quantitativen oder einen qualitativen Nachweis von Analyten in einer Probe ermöglicht. Es sind ein paar Voraussetzungen bei der Entscheidung zu berücksichtigen, ob der ELISA ein kompatibler Assay für Ihren Verwendungszweck ist. Als geeigneter Kandidat für die Verwendung in einem ELISA sollten ein Analyt und eine Probe mindestens die folgenden grundlegenden Kriterien erfüllen:

  • Der Analyt muss von einem Antikörper erkannt werden können.
  • Der Analyt mussin einer wässrigen Probe mit angemessenem Volumen vorhanden sein. (In der Regel 50-200 µl nach Verdünnung).
  • Die Probe darf keine Substanz enthalten, die eine Antigenerkennung oder einen kolorimetrischen Nachweis beeinträchtigt.
  • Der Analyt muss in ausreichender Menge in der Probe vorhanden sein, um einen Nachweis zu ermöglichen.
  • Neben der Kenntnis, welche Art von Proben kompatibel mit dem ELISA sind, ist es auch hilfreich zu wissen, welche Art von Proben mit dem ELISA-Format nicht kompatibel sind. Probenarten oder Analyte können möglicherweise mit dem ELISA-Format aufgrund einer Vielzahl von technischen Gründen nicht kompatibel sein. Im Folgenden sind einige Beispiele für Voraussetzungen aufgeführt, die eine Probe mit dem ELISA herkömmlicherweise inkompatibel machen:

  • Analyten, die nur in Spuren in einer Probe vorhanden sind.
  • Analyten, für die eine Antikörpergenerierung belanglos ist. (Z. B. sehr kleine Moleküle)
  • Proben, die Detergenzien, starke Säuren oder starke Basen enthalten.
  • Proben, die dunkle Pigmente enthalten, die möglicherweise eine Mikrotiterplatte oder einen
  • Hinweis:Wenn ein ELISA aus unterschiedlichen technischen Gründen nicht geeignet ist, kann antibodies-online in der Regel eine andere Lösung anbieten. Z. B. Für kleinmolekulare Ziele, die mit ELISA schwierig oder unpraktisch zu analysieren sind, können wir möglicherweise ein anbieten. Wenn Sie Probleme haben, die richtigen Tools zur Durchführung eines schwierigen Experiments zu finden,wenden Sie sich bitte an einen unserer qualifizierten technischen Support-Wissenschaftler. . Er sind möglicherweise in der Lage, Ihnen eine Option zu unterbreiten, die Sie nicht in Erwägung gezogen hatten.

    Der ELISA hat etliche Vorteile. Es ist ein schneller, skalierbarerund spezifischer Assay, der es zu einem leistungsstarken und unverzichtbaren Tool im Sortiment eines Forschers macht. Die erzielten Ergebnisse können qualitativ, semiquantitativ oder vollständig quantitativ sein (je nach Anordnung des durchgeführten Assays). Die ELISA-Technologie ist äußerst genial in ihrer Einfachheit; ist erst einmal ein individueller Assay optimiert, kann ein minimal geschulter Techniker in der Regel zwischen 100 bis 200 Proben in nur wenigen Stunden über den ELISA analysieren. Standards und Proben werden häufig doppelt (mindestens) durchgeführt und machen den ELISA zu einem recht robusten Assay, der toleranter gegenüber Benutzerfehlern oder stochastischer Probenvariation als viele alternative Methoden ist .

    Dennoch stößt der ELISA an Grenzen. Die grundlegende Natur eines ELISA begrenzt einen einzelnen Assay zum Nachweis eines einzelnen Ziels. Da der Assay von der Bindung des Analyten durch einen Antikörper abhängig ist, kann ein ELISA nicht zwischen antigenisch identischen Analyten (verschiedene Ziele, die durch den gleichen Antikörper erkannt werden) unterscheiden. Der gleiche ELISA-Assay wird beispielsweise oft viele oder alle unterschiedlichen Isoformen des gleichen Proteins in einer Probe erkennen. Der Assay macht auch die Verfügbarkeit eine Spezialausrüstung erforderlich, wie z. B. einen spektralfotometrischen Mikroplatten-Reader zur ordnungsgemäßen Durchführung der Analyse. Das ELISA-Format ist auch am kostengünstigsten, wenn viele Proben analysiert werden. Ein einziges 96-Test-Kit kann in der Regel 40 Proben in zweifacher Ausfertigung sowie eine 8-Proben-Standardkurve analysieren. Viele Forscher finden die Kosten eines ELISA-Kit unerschwinglich für kleine Studien, um nur eine Handvoll von Proben zu untersuchen.

    Hinweis: Wenn Sie mehrere Ziele in einem einzigen praktischen Schritt analysieren möchten, haben Sie vielleicht Interesse an unserem großen Sortiment an Multiplex-Assays und Antikörper-Arrays.

    Die wesentlichen Nachteile im Zusammenhang mit dem ELISA wurden durch Fortschritte in der Technologie weitgehend entschärft. Heute besitzen die meisten akademischen und privaten Forschungseinrichtungen den speziellen Platten-Reader sowie andere Ausrüstung, die zur Durchführung der einzelnen Schritte in einem ELISA notwendig sind. Zusätzlich hat der Wettbewerb im Markt den Preis von fertigen ELISA-Kits gesenkt und es wird in der Regel ein besserer Wert pro untersuchter Probe geboten als bei vielen anderen herkömmlichen Proteomik-Methoden. Allerdings sollte man dennoch seine Wahl einer experimentellen Anordnung sorgfältig überlegen und die Stärken und Schwächen des ELISA-Formats gegenüber allen Optionen bei der wichtigen Entscheidung darüber, welche Techniken man einsetzt, abwägen.

    Eine Analyse aufbauen oder ein Kit kaufen?

    Wenn Sie beschlossen haben, einen ELISA zu verwenden, müssen Sie entscheiden, ob Sie ein kommerziell verfügbares ELISA-Kit verwenden werden oder versuchen, einen Assay von Grund auf selbst zusammenzustellen. Es gibt einige Gründe, warum man unter Umständen versuchen möchte, einen Assay de novo zu entwickeln, anstatt eine fertige Lösung zu kaufen. Wenn Sie Ihren Assay außerhalb der Spezifikationen in einem handelsüblichen Kit abstimmen müssen, wenn Sie eine strikte Kontrolle über die spezifische Art der Komponenten, die in ihren Assay enthalten sind, benötigen oder wenn Sie einen speziellen oder maßgeschneiderten Antikörper in Ihrem Assay verwenden müssen, sollten Sie sich überlegen, die notwendige Zeit und Mühe in einen Assay de novo zu investieren.

    Hinweis: Wenn Sie einen Assay de novo erstellen müssen, bietet antibodies-online Hunderttausende von ELISA-geprüften Komponenten wie Antikörper, Proteine and Zubehörreagenzien.

    Wenn Sie jedoch nicht auf die oben genannten Kriterien beschränkt sind, möchten Sie der Einfachheit halber vielleicht den Kauf eines handelsüblichen Assays in Erwägung ziehen. Sollten Sie den Kauf eines fertigen Kits erwägen, wenn Sie:

  • Zeit sparen möchten: Die Optimierung eines benutzerdefinierten ELISA ist sehr zeitaufwändig. Selbst für einen mit kompatiblen Reagenzien erfahrenen Wissenschaftler erfordert ein neuer Assay in der Regel Stunden oder Tage der Optimierung, bevor er einsatzbereit ist. Das ist Zeit, die Sie verwenden könnten, um Ihre Daten zu sammeln, zu analysieren, zu interpretieren und zu veröffentlichen. Prüfen Sie sorgfältig, wie wertvoll Ihre Zeit und die Zeit der Techniker und Studenten ist, die den Assay aufbauen und durchführen.

  • Die Reagenzkompatibilität sicherstellen möchten: Ein fertiger enthält garantiert Reagenzien, die miteinander kompatibel sind. Auch wenn Sie qualitativ hochwertige Reagenzien wählen, können Sie beim Erstellen Ihres eigenen Assay versehentlich auf inkompatible Produkte treffen (z. B. zwei Antikörper, die ein ähnliches Epitop erkennen und sich gegenseitig aufgrund sterischer Behinderung blockieren).

  • Frustrierende Probleme mit der Qualitätskontrolle vermeiden möchten: Beim Erstellen eines Assays von Grund auf werden Sie wahrscheinlich verschiedene Reagenzien von unterschiedlichen Quellen beschaffen. Und nachdem Sie die Zeit damit verbracht haben, die erforderlich ist, um jedes der verschiedenen benötigten Reagenzien aufzuspüren, könnte selbst ein einziger schlechter Puffer Ihr Experiment zunichte machen, und unzählige Stunden der Fehlerbehebung erforderlich machen, um die Ursache des Problems zu finden. Im Gegensatz dazu wird jedes fertige ELISA-Kit von antibodies-online durch unsere Geld-zurück-Garantie abgedeckt. In dem unwahrscheinlichen Fall, dass Sie auf ein Problem stoßen, arbeiten unsere Mitarbeiter im technischen Support an der Fehlerbehebung.

  • Geld sparen möchten:Obwohl es verlockend sein mag, Ihren eigenen ELISA zusammenzustellen, um ein paar Euro zu sparen, finden die meisten Forscher, dass die Kosten-Nutzen-Analyse am Ende sich nicht wirklich auszahlt. Nach Prüfung aller verschiedenen Komponenten, die zur Erstellung eines Assays de novo angeschafft werden müssen, ist es oft ebenso kostengünstig, ein fertiges Kit zu kaufen.

  • Gleichgültig, ob Sie sich zum Kauf eines gebrauchsfertigen ELISA von einem unserer entschieden haben, oder Ihren eigenen Assay von Grund auf entwickeln, möchten Sie womöglich eine wenig mehr über die verschiedenen Assay-Anordnungen wissen, die verfügbar und gebräuchlich sind. Weitere Informationen zu den verschiedenen ELISA-Formaten, die bei antibodies-online handelsüblich sind, finden Sie in Eine Einführung in die ELISA-Methode (Teil 2).

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