Marker

In der analytischen Biochemie sind Marker essentiell um Forschungsergebnisse zu interpretieren. Ohne ihre Hilfe kann die Auftrennung von DNA Fragmenten oder Proteinen per Gelelektrophorese oder z.B. SDS-PAGE nicht gedeutet werden. Wissenschaftler beladen eine zusätzliche Kammer mit dem Marker. Dieser enthält mehrere bekannte DNA-Stränge oder Proteine in der Größenordnung der Probe. Nach der Auftrennung bilden die separierten Banden (oftmals in regelmäßigen Abständen) die Sprossen einer Leiter ab, weshalb man auch von DNA Ladder bzw. Protein Ladder spricht. Die Banden der Probe werden nun mit der Ladder verglichen und so deren Größe bestimmt. Obwohl Marker nicht für die quantitative Analyse bestimmt sind, kann man mithilfe der Bandenintensität der Probe im Vergleich zur Markerbande und der (berechneten) Menge an Marker, mit der das Gel beladen wurde, grob Rückschlüsse auf die geladene Probe ziehen.

Da Proteine als auch Nukleinsäuren nahezu farblos sind, kann der Fortschritt der Gelelektrophorese nur schlecht eingeschätzt werden. Deshalb beinhaltet der Puffer gewöhnlich anionische Farbstoffe mit bekannter, hoher elektrophoretischer Mobilität. Diese erreichen als erste die Anode und dienen als visuelles Signal den Prozess zu stoppen. Häufig benutzte Tracking Farbstoffe sind Xylene cyanol, cresol Red, Bromophenol blue, Orange G oder auch Tartrazine. Sie unterscheiden sich leicht in ihrer Mobilität.

DNA Ladders & Färbung

In den letzten Jahrzehnten war Ethidiumbromid die vorherrschende Färbemethode für Nukleinsäuren da es preiswert als auch hinreichend sensitiv ist. Einzelne Ethidiumbromid-Moleküle interkalieren dabei zwischen die Basen der DNA, wodurch sich das Anregungsspektrum von Ethidiumbromid verändert und so die Fluoreszenz der Substanz bei Anregung mit ultraviolettem Licht stark erhöht wird. Es steht jedoch schon lange im Verdacht mutagen zu wirken und Krebs zu verursachen. Zusätzlich kann UV-Licht, bei unsachgemäßer Benutzung zu Haut- und Augenschäden führen. Auch die DNA der Probe wird in Mitleidenschaft gezogen. Die mögliche Formation von TT-Dimeren erschwert nachfolgende Experimente.

Deshalb wurden in den letzten Jahren mehrere Alternativen zur Ethidiumbromidfärbung entwickelt, wie z.B. SYBR®, GelRed™ und GelGreen™. Sie weisen zwar alle eine verringerte mutagene Wirkung auf, bringen jedoch vielfach gewisse andere Nachteile mit sich, so dass man nach wie vor auf eine einwandfreie Handhabung achten muss.

GelRed™ und GelGreen™ haben eine geringere Toxizität da verhindert wird, dass die Farbstoffe in lebende Zellen eindringen. Zusätzlich sind sie nicht gefährlich oder toxisch für Wasserlebewesen.

SYBR Green I wird als Ersatz für das potentielle menschliche Mutagen Ethidiumbromid vermarktet, da sowohl die Arbeit als auch die Entsorgung sicherer und einfacher sind.

Der Farbstoff Novel Green (externer Link) zeichnet sich dadurch aus, dass anstelle von UV-Licht auch blaues Licht bei 497nm genutzt werden kann.

Novel Green färbt DNA Banden in einer Elektrophorese in 2 einfachen Schritten. Novel Green besitzt dabei eine hohe Sensitivität und gute Qualität auf dem Gel. Wir empfehlen es auch für den Einsatz bei quantitativen Applikationen wie z.B. real-time PCR und qPCR. Sollte Novel Green für Ihre Versuche in Frage kommen, versuchen Sie doch unser Produkt OneMARK 100 (ABIN2868514), erhältlich in unserem Shop.

Wie oben erwähnt hängt die korrekte Markerwahl von der Länge der DNA Fragmente ab. Zur Größenbestimmung von sehr großen DNA-Fragmenten empfiehlt sich ein Lambda DNA/Hind III Marker (ABIN1540476). Isolierte DNA der Enterobacteria Phage λ wird mit dem Restriktionsenzym Hind III verdaut, man erhält so einen Mix aus Fragmenten definierter Länge, die ein großes Spektrum abdecken.

Protein Ladders & Färbung

Protein Ladders können für eine Reihe von Applikationen eingesetzt werden, wie z.B. die Überprüfung der Proteinseparierung während einer SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese, der Transfereffizienz auf eine Membran während eines Westernblots oder der genauen Bestimmung von Proteingrößen. Um Proteine sichtbar zu machen, muss eine proteinspezifische, farbstoffbindende oder farbproduzierende chemische Reaktion im Gel an den Proteinen durchgeführt werden. Die am häufigsten gebrauchten Reaktionen sind unten aufgeführt.

Kolorimetrische Färbung

Coomassie Brilliant Blue ist die gängigste Färbemethode für Proteine. Sie ist einfach in der Durchführung und reversibel, die Proteine werden also nicht permanent chemisch modifiziert. Coomassie Brilliant Blue ist ein anionischer Farbstoff der unspezifisch an Proteine bindet. Die Struktur ist vorherrschend unpolar und es wird in einer Methanollösung mit Essgsäure gesäuert. Proteine im Gel werden mit Essigsäure fixiert und gleichzeitig gefärbt. Coomassie bindet an basische und hydrophobe Reste der Proteine und verändert die Farbe von einem matten rotbraun in intensives blau. Der überschüssige Farbstoff im Gel kann durch Waschen mit der gleichen Lösung, nur ohne Coomassie Brilliant Blue, entfernt werden. Die Klassische Coomassie Brilliant Blue Färbung kann Proteinbanden im Bereich von 25-50 ng nachweisen.

Die Protein Ladder kann mit verschiedenen Farbstoffen gefärbt werden, dies erleichtert die Orientierung auf dem Gel. Unser Smart Multi Color Pre-Stained Protein Standard (ABIN1536541) z.B. besteht aus 6 vorgefärbten Proteinen zwischen 14 und 100 kDa. Die Proteine der Größe 40 kDa und 100 kDa sind kovalent an einen orangenen Farbstoff gekoppelt, das 14 kDa Protein an einen hellgelb leutchtenden Farbstoff.

Proteinfärbung mit Silber stellt die sensitivste kolorimetrische Methode dar. Die Proteine werden denaturiert, das Gel in Wasser gewaschen und in einer Silbernitratlösung inkubiert. Dabei lagern sich Silberionen an negativ geladene Seitenketten der Proteine an. Überschüssiges Silber wird anschließend mit Wasser abgewaschen. Bei dem abschließenden Entwicklungsschritt werden die Silberionen durch Zugabe von alkalischem Formaldehyd zu elementarem Silber reduziert. Dieses färbt die Stellen, an denen Proteine vorhanden sind, schwarz. Die Nachweisgrenze liegt bei 0,1 ng bis 1 ng pro Bande. Ausrüstung und Chemikalien sind simpel und günstig, jedoch kann die Anwendung Schwierigkeiten bereiten. Rückstände in Reagenzgefäßen verändern die Ergebnisse, Keratin führt oft zu Artefaktbildung. Zusätzlich entscheidet die Primärstruktur in großem Maße über die Intensität der Färbung.

Fluoreszenzfärbung

In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Fluoreszenzfärbungen etabliert. Viele verbinden eine gute Färbung mit schneller und einfacher Durchführung. Die nützlichsten haben ein Anregungs- und Emmissionsmaxima das mit Filtersets und Lasereinstellungen gängiger Fluoreszenzimaging-Instrumente übereinstimmt. Unser Protein Marker for Fluorescent Western Blotting (ABIN1536542) wurde eigens für die Identifikation von Proteinbanden in Fluoreszenz-Westerblots entwickelt. Der Farbstoff ermöglicht direkte Visualisierung von Marker als auch Probe auf einer Westernblot Membran, ohne zusätzliche Chemikalien.

Produkte wie die Chameleon™ 800 Pre-stained Protein Ladder (ABIN2737872) vereinen kolometrische und fluoreszierende Färbung. 6 rekombinante Proteine (8 bis 260 kDa) sorgen für eine verschiedenfarbige Abdeckung im sichtbaren und zusätzlich im infraroten Bereich(800 nm). Die Ladder ist gebrauchsfertig für SDS-PAGE und ist ideal für die Kontrolle der elektrophoretischen Separation, Bestimmung des Molekulargewichts und der Effizienz eines Blottransfers.

Chemolumineszenzfärbung

Unter Chemolumineszenz versteht man die Emission von Photonen im sichtbaren Bereich(Lumineszenz) mithilfe einer chemischen Reaktion. Im Vergleich zur Fluoreszenz weist Chemolumineszenz eine doppelt so hohe Sensitivität auf.

Der Protein Molecular Weight Marker (ABIN2843754) ist speziell für Chemolumineszenzassays entworfen worden. Der Marker ist biotinyliert und wirkt im Zusammenspiel mit Streptavidin-HRP. Die Streptavidin-Biotin-Bindung ist eine der stärksten bekannten nichtkovalenten biologischen Bindungen und sorgt so für eine hohe Sensitivität. Die Meerrettichperoxidase (HRP) liefert Protonen für die für die Farbreaktion des Luminols.