Chromatin immunoprecipitation (ChIP)

Die Epigenetik untersucht vererbbare zelluläre und physiologische Merkmale, die durch andere Faktoren als die DNA-Sequenz bestimmt werden. Beispiele hierfür sind einfache chemische Modifikationen wie die Methylierung und Acetylierung von DNA und mit ihr interagierenden Molekülen. Diese Veränderungen sind reversibel und verändern die Nukleotidsequenz nicht direkt. Sie spielen jedoch eine wichtige Rolle bei der Regulation, wie, wo und wann bestimmte Gene exprimiert werden.

Diese epigenetischen Veränderungen können über Zellteilungen hinweg während der gesamten Lebensdauer einer Zelle bestehen bleiben und teilweise sogar über mehrere Generationen weitergegeben werden, obwohl sie keine Veränderungen der zugrunde liegenden DNA-Sequenz des Organismus beinhalten. Die epigenetische Forschung kann dazu beitragen, Mechanismen des Alterns, der menschlichen Entwicklung sowie die Entstehung verschiedener Erkrankungen wie Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und psychischer Erkrankungen besser zu verstehen.

Kartierung von Protein-DNA-Interaktionen mit ChIP

Die Immunpräzipitation von Protein-DNA-Komplexen (ChIP) ermöglicht die Untersuchung epigenetischer Zusammenhänge. Mit dieser Methode können Bindungsstellen DNA-assoziierter Proteine identifiziert und insbesondere Transkriptionsfaktoren näher untersucht werden. Nach einer gezielten Fragmentierung der Chromatinstruktur erfolgt die Chromatin-Immunpräzipitation. Ähnlich wie bei der konventionellen Immunpräzipitation werden bei ChIP Antikörper eingesetzt, die bestimmte Proteine selektiv erkennen, binden und isolieren. Dazu gehören Histone, modifizierte Histone, Transkriptionsfaktoren und Kofaktoren. Die damit verbundenen DNA-Sequenzen können anschließend mittels Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung identifiziert werden. Dieses Verfahren wird als ChIP-Seq bezeichnet.

Varianten von ChIP

Für ChIP haben sich verschiedene Varianten etabliert. Bei X-ChIP wird das Zielprotein mithilfe von Formaldehyd mit der DNA quervernetzt. Die Fragmentierung des Chromatins erfolgt anschließend durch Ultraschallbehandlung oder Nukleaseverdau.

Bei Native ChIP wird Chromatin aus Zellkernen isoliert, die zuvor mit einer Nuklease behandelt wurden. Anschließend wird das Chromatin mithilfe einer Mikrokokken-Nuklease fragmentiert, welche die DNA bevorzugt im Bereich der Linker-DNA schneidet.

Native ChIP

Vorteile:

• Überprüfbare Antikörperspezifität
• Verbesserte Antikörperspezifität durch native Proteine
• Bessere Rückgewinnung von Chromatin und Proteinen

Nachteile:

• Nicht für Nicht-Histon-Proteine geeignet
• Nukleosomen können sich während des Verdaus neu anordnen

Cross-linked ChIP

Vorteile:

• Für Transkriptionsfaktoren geeignet
• Bei praktisch allen Organismen anwendbar

Nachteile:

• Geringere Chromatin-Rückgewinnung
• Kann zu falsch-positiven Ergebnissen führen
• Zufällige Fragmentierung durch Sonifikation führt zu einer größeren Variabilität der Chromatinfragmentlängen

CUT&RUN – Leistungsfähige Alternative zu ChIP-Seq

CUT&RUN-Sequenzierung, auch bekannt als Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease, ist eine Methode zur Analyse von Protein-DNA-Interaktionen. CUT&RUN kombiniert eine antikörpergerichtete, kontrollierte Spaltung durch eine Mikrokokken-Nuklease mit massiv paralleler DNA-Sequenzierung, um die Bindungsstellen DNA-assoziierter Proteine zu identifizieren.

Vorteile von CUT&RUN

• Keine Quervernetzung erforderlich; die auf beiden Seiten eines gebundenen Proteinkomplexes geschnittene DNA wird effizient in die Lösung freigesetzt
• Die begrenzte Chromatinspaltung im unmittelbaren Bereich der Zielstellen minimiert unspezifische Fragmente
• Besseres Signal-Hintergrund-Verhältnis
• Deutlich geringere erforderliche Sequenziertiefe
• Auch für geringe Probenmengen geeignet

Beliebte Antikörper für ChIP