Antibody and immunoglobulin alternatives (Part 1)

Antikörper: eine kurze Geschichte

Die früheste Erwähnung von Antikörpern geht auf die Arbeiten von Emil von Behring (der 1901 für seine Arbeiten mit dem Nobelpreis ausgezeichnet wurde) und Shibasabura Kitasato aus dem Jahr 1890 zurück. Sie zeigten, dass Serum von gegen Diphtherie und Tetanus immunisierten Tieren infizierte Tiere heilen konnte. Im Jahr 1900 entwickelte Paul Ehrlich seine Theorie der Antikörperbildung in Übereinstimmung mit der „Schlüssel-Schloss“-Hypothese, die ursprünglich von Emil Fischer für die Wechselwirkung von Enzymen mit ihren Substraten vorgeschlagen worden war.

Der erste Antikörper-Isotyp (Immunglobulin G, IgG) wurde 1939 von Arne Tiselius und Elvin Kabat entdeckt, und 1948 beschrieb Astrid Fagraeus die Antikörperproduktion in Plasmazellen. Die molekulare Struktur von Antikörpern wurde 1959 unabhängig voneinander von Gerald Edelman und Rodney Porter beschrieben, wofür sie 1972 gemeinsam mit dem Nobelpreis ausgezeichnet wurden.

Die klonale Selektionstheorie wurde 1957 von Frank MacFarlane Burnet und David W. Talmage etabliert und 1976 durch Susumu Tonegawas Beschreibung der Rekombination von Ig-Genen erweitert. Im Jahr 1975 folgten die erste Erzeugung von Hybridomen und die Entwicklung monoklonaler Antikörper durch Georges Köhler und César Milstein. 15 Jahre später wurde die Phagen-Display-Technik von John McCafferty, Andrew D. Griffiths, Greg Winter und David J. Chiswell weiterentwickelt.

Verbesserungspotenzial

Antikörper sind heute ein Grundpfeiler der Proteomikforschung. Die Herstellung und Aufreinigung von Antikörpern wurde im Laufe der vergangenen 125 Jahre kontinuierlich weiterentwickelt. Dennoch ist die Antikörperproduktion ein ressourcenintensiver Prozess.

Die Immunisierung eines Wirtstieres kann anspruchsvoll und kostspielig sein. Hochtoxische oder stark konservierte Antigene lösen typischerweise nur eine schwache Immunantwort aus, sodass der Einsatz eines Adjuvans erforderlich sein kann, um die Antikörperproduktion zu stimulieren. Der Immunisierungsprozess dauert üblicherweise etwa drei Monate. Abhängig von der Reaktion des immunisierten Tieres können zusätzliche Booster-Immunisierungen erforderlich werden, wodurch sich das Protokoll bis zur abschließenden Blutentnahme um mehrere Wochen verlängert.

Die Fusion von antikörperproduzierenden B-Zellen, die aus der Milz des Tieres isoliert wurden, mit Myelomzellen zur Erzeugung monoklonale Antikörper produzierender Hybridomzellen stellt einen zusätzlichen komplexen Schritt bei der Herstellung monoklonaler Antikörper dar. Unabhängig von den anschließenden Selektions-, Screening- und Aufreinigungsschritten kann die Herstellung monoklonaler Antikörper aus einer neu etablierten Hybridomzelllinie problemlos ein Jahr oder länger dauern.

Sowohl bei der polyklonalen als auch bei der monoklonalen Antikörperproduktion ist üblicherweise die Tötung des immunisierten Tieres erforderlich. Darüber hinaus wachsen einige Hybridome erst, nachdem sie in die Peritonealhöhle injiziert wurden, wo sie eine antikörperreiche Flüssigkeit, den sogenannten Aszites, produzieren. Dieser Prozess verursacht den Tieren erhebliche Schmerzen und wird daher vermieden, wenn alternative Verfahren zur Verfügung stehen. Folglich sind mit der konventionellen Antikörperproduktion auch ethische Fragestellungen verbunden.

Neben den Herausforderungen bei der Herstellung bieten auch einige biochemische Eigenschaften konventioneller Antikörper Verbesserungspotenzial. Häufig verwendete Antikörper wie IgG sind mit einem Molekulargewicht von etwa 150 kDa relativ groß. Ein großer Teil dieses Molekulargewichts ist für die Bindungseigenschaften des Antikörpers nicht unmittelbar erforderlich, da die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDR) der schweren und leichten Ketten nur einen kleinen Teil des gesamten Antikörpers ausmachen. Diese Größe wird insbesondere bei Techniken wie der Immunhistochemie relevant, bei denen Antikörper Barrieren wie die Plasmamembran überwinden müssen, um ihr vorgesehenes Ziel zu erreichen.

Schließlich kann die Bindungsaffinität von Antikörpern erheblich variieren. Zwischen verschiedenen Chargen sind Unterschiede über mehrere Größenordnungen hinweg üblich, häufig von mikromolaren bis zu pikomolaren Werten. Die Affinitätskonstanten monoklonaler Antikörper sind tendenziell etwas geringer als die der besten Binder innerhalb einer Population polyklonaler Antikörper. Polyklonale Antikörper weisen dagegen ein höheres Hintergrundsignal und eine stärkere Variabilität zwischen verschiedenen Chargen auf.

Alternativen zu konventionellen Immunglobulinen

Der Druck, Alternativen zu traditionellen Immunglobulinen zu entwickeln und zu optimieren, nimmt stetig zu. Sowohl von Immunglobulinen abgeleitete Produkte als auch nicht auf Ig basierende Alternativen gewinnen zunehmend an Bedeutung, was zu einem großen Teil auf die oben genannten Einschränkungen zurückzuführen ist.

Rekombinante Antikörper

Rekombinante Antikörper sind Reagenzien für die Affinitätsproteomik, die von der Sequenz konventioneller Immunglobuline abgeleitet sind, jedoch transgen in einem Wirtsorganismus produziert werden. Im Gegensatz zu Antikörpern, die von einem Wirtstier als Reaktion auf die Exposition gegenüber einer immunogenen Substanz gebildet werden, werden rekombinante Antikörper¹ ausgehend von der codierenden DNA in prokaryotischen oder eukaryotischen Expressionssystemen hergestellt. Dadurch wird gewährleistet, dass die produzierten Antikörper – ähnlich wie monoklonale Antikörper – von Charge zu Charge identisch sind.

Aufgrund der komplexen heterotetrameren Struktur von Antikörpern und der Bedeutung einer korrekten posttranslationalen Prozessierung, beispielsweise der Glykosylierung, werden vollständige rekombinante Antikörper überwiegend in eukaryotischen Expressionssystemen hergestellt. Weitere Faktoren, beispielsweise die reduzierenden Bedingungen im Zytoplasma von E. coli, erschweren die rekombinante Antikörperproduktion zusätzlich. Diese Schwierigkeiten konnten teilweise durch die Herstellung kleinerer Antikörperfragmente umgangen werden, die weiterhin in der Lage sind, ein gewünschtes Antigen spezifisch zu erkennen.

Rekombinante Antikörper und Ig-Fragmente

Immunglobuline (Ig) sind komplexe Heterotetramere, die aus zwei leichten und zwei schweren Ketten bestehen. Diese sind strukturell jeweils in variable Regionen (VH, VL) und konstante Regionen (CH1, CH2, CH3, CL) gegliedert und durch Disulfidbrücken (gelbe Linien) miteinander verbunden. Cameliden-HCAb sind Homodimere mit jeweils zwei komplementaritätsbestimmenden Regionen auf einer Aminosäurekette. Von beiden Antikörperklassen sind verschiedene Fragmente verfügbar, die andere Eigenschaften als ihre Ausgangsmoleküle aufweisen (siehe Text).

Das kleinste antigenbindende Fragment ist das Immunglobulin-Fv-Fragment, das nur aus einer variablen Domäne der schweren Kette besteht. Die geringe Stabilität des Fv-Fragments führte zur Entwicklung einzelkettiger Fv-Fragmente (scFv), bei denen jeweils eine variable Region der leichten und der schweren Kette durch einen löslichen Linker miteinander verbunden ist. scFv-Fragmente stellen die kleinsten Fragmente dar, die eine vollständige Bindungsstelle eines Antikörpers enthalten, und sind derzeit das am weitesten verbreitete Format rekombinanter Antikörper mit zahlreichen Anwendungen im Gesundheitswesen und in der Biotechnologie. Die Weiterentwicklung dieser Plattform führte außerdem zu bi- oder trivalenten scFvs und Diabodies mit niedrigeren Affinitätskonstanten sowie zu bispezifischen Antikörpern, die unterschiedliche Antigene miteinander vernetzen können und daher vielversprechende Kandidaten für Krebstherapeutika darstellen, beispielsweise BiTEs. Da alle diese Varianten als einzelne Peptidkette produziert werden, werden sie weiterhin von nur einem Gen codiert.

Während das Fehlen des Fc-Fragments eines vollständigen Antikörpers bei bestimmten Anwendungen von Vorteil sein kann – ähnlich wie bei F(ab’)2- und Fab-Antikörperfragmenten –, ist es bei anderen Anwendungen notwendig, die Eigenschaften eines Immunglobulins zu erhalten, beispielsweise bei Verwendung eines gegen die Fc-Region gerichteten Sekundärantikörpers. Durch die Fusion von Antikörperfragmenten mit dem Fc-Fragment des betreffenden Immunglobulins entsteht ein Molekül, das hinsichtlich Funktion und Avidität praktisch nicht vom nativen Antikörper zu unterscheiden ist.

Rekombinant produzierte Antikörper gewinnen in der Forschung zunehmend an Interesse und Bedeutung. Derzeit bietet antibodies-online eine Auswahl an

Darüber hinaus bietet antibodies-online eine Reihe chimärer, teilweise humanisierter Antikörper gegen relevante Antigene von HIV, HCV und BPV-1 an.

Neben rekombinant produzierten traditionellen Ig-Derivaten gewinnen auch Alternativen, die von Schwerkettenantikörpern (hcAb) abgeleitet sind, zunehmend an Bedeutung. Homodimere hcAbs von Cameliden² und der Immunoglobulin New Antigen Receptor (IgNAR)³ von Knorpelfischen bestehen lediglich aus zwei schweren Ketten und besitzen nicht die für Ig-Antikörper typischen leichten Ketten. Die Antigenbindungsstelle des HCAb von Dromedaren befindet sich innerhalb einer einzigen Domäne, die als variable Domäne der schweren Kette des HCAb (VHH) bezeichnet und umgangssprachlich als Nanobody⁴ bekannt ist. Diese Nanobodies sind besonders klein und können mithilfe rekombinanter Techniken mit außergewöhnlich hoher Qualität und praktisch ohne Chargenvariabilität hergestellt werden.

Nanobodies sind kleine, rekombinant produzierte antigenbindende (V_HH)-Fragmente, die von Camelidae abgeleitet sind. Nanobodies haben in der Forschungsgemeinschaft eine außerordentlich große Verbreitung gefunden – und das aus gutem Grund. Die einzigartigen Eigenschaften von Nanobodies ermöglichen ihren Einsatz in zahlreichen Anwendungen und erlauben ihnen, Funktionen zu übernehmen, für die konventionell hergestellte Antikörper nicht geeignet sind.

Weitere Informationen

Alternativen zu Antikörpern und Immunglobulinen (Teil 2) behandelt Alternativen zu konventionellen mono- und polyklonalen Antikörpern, die nicht von Ig-Sequenzen abgeleitet sind.

Literatur