Sekundäre Antikörper
antibodies-onlineSekundärantikörper binden an Primärantikörper und nicht direkt an das Zielantigen. Sie werden häufig zur Signaldetektion und Signalverstärkung in Methoden wie Western Blotting, Immunhistochemie (IHC), Immunfluoreszenz (IF), Durchflusszytometrie, ELISA und Immunpräzipitations-basierten Workflows eingesetzt.
Bei der Auswahl des geeigneten Sekundärantikörpers reicht es nicht aus, lediglich die Spezies des Primärantikörpers zu berücksichtigen. Wichtige Parameter sind die Wirtsspezies des Primärantikörpers, die Immunglobulinklasse bzw. -subklasse, die Bindungsspezifität, der Grad der Kreuzadsorption, das Antikörperformat sowie die für die jeweilige Anwendung erforderliche Detektionsmarkierung.
Auswahl eines Sekundärantikörpers
Bei der Auswahl eines Sekundärantikörpers sollten die folgenden Parameter berücksichtigt werden:
- Bestimmen Sie die Wirtsspezies des Primärantikörpers. Ein in Kaninchen erzeugter Primärantikörper erfordert einen Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper, während für einen Maus-Primärantikörper ein Anti-Maus-Sekundärantikörper benötigt wird.
- Bestimmen Sie die Immunglobulinklasse und, falls relevant, die Subklasse. Ein monoklonaler Maus-IgG1-Antikörper kann beispielsweise mit einem allgemeinen Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper oder mit einem IgG1-subklassenspezifischen Sekundärantikörper detektiert werden.
- Wählen Sie die erforderliche Antikörperspezifität. Je nach Experiment kann dies ein IgG-(H+L)-, schwere-Ketten-spezifischer, Fc-spezifischer, Fab-spezifischer oder subklassenspezifischer Sekundärantikörper sein.
- Berücksichtigen Sie die Kreuzadsorption. Kreuzadsorbierte Sekundärantikörper können unerwünschte Bindungen an Immunglobuline der Probenspezies oder an andere in Multiplex-Experimenten verwendete Primärantikörper reduzieren.
- Wählen Sie das geeignete Antikörperformat. Volllängen-IgG eignet sich für viele allgemeine Detektionsanwendungen, während F(ab')2- oder Fab-Fragmente bei Experimenten mit Fc-Rezeptoren, bei Anforderungen an die Gewebepenetration oder bei speziellen Multiplex-Protokollen vorteilhaft sein können.
- Wählen Sie das Konjugat entsprechend der Detektionsmethode. Zu den häufig verwendeten Optionen zählen HRP, alkalische Phosphatase, Biotin sowie Fluoreszenzfarbstoffe wie FITC, PE, Alexa Fluor und DyLight.
- Stellen Sie sicher, dass der Sekundärantikörper für die vorgesehene Anwendung validiert oder geeignet ist. Die Anforderungen unterscheiden sich zwischen Western Blotting, ELISA, IHC, IF, Durchflusszytometrie und anderen Methoden.
Wichtige Terminologie: Die Target-Spezies bzw. Reaktivität eines Sekundärantikörpers bezeichnet die Spezies, in der der Primärantikörper erzeugt wurde. Die Wirtsspezies des Sekundärantikörpers bezeichnet dagegen das Tier, in dem der Sekundärantikörper selbst erzeugt wurde.
Antikörperklasse, Subklasse und Bindungsspezifität
Immunglobulinklassen werden durch ihre schweren Ketten definiert. Bei Säugetieren sind die wichtigsten Immunglobulinklassen IgG, IgM, IgA, IgE und IgD. Ihre schweren Ketten werden als Gamma, Mu, Alpha, Epsilon bzw. Delta bezeichnet. Immunglobuline enthalten zusätzlich entweder Kappa- oder Lambda-Leichtketten.
Die Spezifität eines Sekundärantikörpers bestimmt, welche Region des Primärantikörpers erkannt wird. Die Wahl der geeigneten Spezifität kann Hintergrundsignale reduzieren und ist insbesondere bei Multiplex-Experimenten von Bedeutung.
- IgG (H+L): erkennt Epitope sowohl auf den schweren als auch auf den leichten Ketten. Diese Antikörper ermöglichen eine breite Erkennung und werden häufig für allgemeine Immunodetektionsverfahren eingesetzt. Da Leichtketten von verschiedenen Immunglobulinklassen gemeinsam genutzt werden, können H+L-Antikörper auch andere Immunglobulinklassen derselben Spezies erkennen.
- Schwere-Ketten-spezifisch: erkennt die schwere Kette einer definierten Immunglobulinklasse wie IgG, IgM oder IgA. Dies ist hilfreich, wenn zwischen verschiedenen Immunglobulinklassen unterschieden werden soll.
- Fc-spezifisch: erkennt Epitope innerhalb der Fc-Region des Primärantikörpers und bindet nicht an Fab-Fragmente.
- Fab-spezifisch: erkennt den antigenbindenden Teil des Primärantikörpers und kann hilfreich sein, wenn Fc-spezifische Interaktionen vermieden werden sollen.
- Subklassenspezifisch: unterscheidet zwischen Immunglobulin-Subklassen wie Maus-IgG1, IgG2a, IgG2b oder IgG3. Subklassenspezifische Sekundärantikörper sind besonders hilfreich, wenn mehrere monoklonale Primärantikörper derselben Spezies in einem Experiment eingesetzt werden.
Kreuzadsorbierte Sekundärantikörper
Immunglobuline verschiedener Spezies weisen strukturell verwandte Epitope auf. Daher kann ein Sekundärantikörper, der gegen Immunglobuline einer bestimmten Spezies gerichtet ist, unter Umständen auch Immunglobuline einer anderen Spezies erkennen. Diese Kreuzreaktivität kann zu Hintergrundfärbung oder zur unbeabsichtigten Detektion anderer im Experiment vorhandener Antikörper führen.
Kreuzadsorbierte Sekundärantikörper werden zusätzlich gegen Immunglobuline oder Serumproteine potenziell kreuzreaktiver Spezies gereinigt. Dadurch wird unerwünschte Spezieskreuzreaktivität reduziert. Dies ist besonders hilfreich bei:
- Multiplex-Immunfluoreszenz oder -Immunhistochemie,
- Proben mit endogenen Immunglobulinen,
- Antikörper-reichen Geweben oder Zellpopulationen,
- Experimenten mit Primärantikörpern aus mehreren Spezies und
- indirekten Sandwich-Immunoassays, in denen Antikörper verschiedener Spezies vorhanden sind.
Bei Gewebefärbungen sollte der Sekundärantikörper idealerweise gegen die Spezies kreuzadsorbiert sein, aus der das Gewebe oder die Zellen stammen. Bei Multiplex-Experimenten sollte jeder Sekundärantikörper darüber hinaus eine möglichst geringe Kreuzreaktivität mit den Spezies der anderen Primärantikörper aufweisen.
Eine umfassende Kreuzadsorption gegen eng verwandte Spezies wie Maus und Ratte kann jedoch die Erkennung bestimmter Epitope reduzieren. Der erforderliche Grad der Kreuzadsorption sollte daher an das jeweilige experimentelle System angepasst werden.
Sekundärantikörper-Formate: Volllängen-IgG, F(ab')2 und Fab
Sekundärantikörper sind als vollständige Immunglobuline oder als Antikörperfragmente erhältlich. Das geeignete Format hängt von der Probe und der jeweiligen Anwendung ab.
| Format | Eigenschaften | Typische Aspekte bei der Auswahl |
|---|---|---|
| Volllängen-IgG | Bivalenter Antikörper mit Fab- und Fc-Regionen. | Geeignet für die meisten Standardanwendungen in Western Blot, ELISA, IF und IHC und ermöglicht in der Regel ein starkes Signal. |
| F(ab')2 | Bivalentes Fragment ohne Fc-Region; entsteht durch proteolytische Spaltung unterhalb der Hinge-Region. | Geeignet für Zellen oder Gewebe mit Fc-Rezeptoren und kann aufgrund seiner geringeren Größe in manchen Proben eine verbesserte Zugänglichkeit bieten. |
| Fab | Monovalentes antigenbindendes Fragment ohne Fc-Region. | Geeignet für Blocking-Strategien, zur Reduzierung Antikörper-vermittelter Quervernetzung und für spezielle Mehrfachmarkierungsprotokolle. |
Wirtsspezies von Sekundärantikörpern
Maus und Kaninchen gehören zu den am häufigsten verwendeten Wirtsspezies für Primärantikörper. Entsprechend werden Anti-Maus- und Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper besonders häufig eingesetzt. Sekundärantikörper selbst können in verschiedenen Wirtsspezies erzeugt werden, darunter Ziege, Esel, Kaninchen und weitere Spezies.
Die Wirtsspezies des Sekundärantikörpers ist insbesondere bei Multiplex-Experimenten von Bedeutung. Wenn möglich, können Sekundärantikörper gegen verschiedene Primärantikörperspezies aus derselben Sekundärantikörper-Wirtsspezies ausgewählt werden. Dadurch wird die Wahrscheinlichkeit reduziert, dass unterschiedliche Sekundärantikörper einander erkennen.
Wenn Sekundärantikörper aus unterschiedlichen Wirtsspezies kombiniert werden müssen, sollte eine geeignete Kreuzadsorption gegen die anderen im Experiment verwendeten Spezies berücksichtigt werden.
Detektionsmarker und Konjugate
Sekundärantikörper sind entweder unkonjugiert oder mit Enzymen, Fluorophoren, Biotin und anderen Detektionsmarkern konjugiert erhältlich. Das optimale Konjugat hängt von der experimentellen Methode, dem Detektionsinstrument, der erforderlichen Sensitivität und davon ab, ob eine Einzel- oder Multiplex-Detektion durchgeführt wird.
- Meerrettichperoxidase (HRP): wird häufig für chemilumineszente und kolorimetrische Detektion in Western Blotting und ELISA eingesetzt. Eine große Auswahl unterschiedlicher Substrate ist verfügbar.
- Alkalische Phosphatase (AP): bietet eine alternative enzymatische Detektionschemie für kolorimetrische oder chemilumineszente Assays. Die relative Sensitivität von HRP und AP hängt vom Substrat, Assayformat und Detektionssystem ab und nicht allein vom verwendeten Enzym.
- Biotin: biotinylierte Sekundärantikörper können mit Avidin- oder Streptavidin-basierten Systemen detektiert werden und eine zusätzliche Signalverstärkung ermöglichen. Bei der Arbeit mit bestimmten Geweben sollte endogenes Biotin berücksichtigt werden.
- Fluorophore: fluoreszierende Konjugate ermöglichen eine direkte optische Detektion und eignen sich insbesondere für Immunfluoreszenz, Durchflusszytometrie und fluoreszierendes Western Blotting.
- Phycoerythrin (PE) und andere fluoreszierende Proteine: werden häufig in der Durchflusszytometrie eingesetzt, wo eine hohe Fluoreszenzintensität von Vorteil ist.
Bei Multiplex-Fluoreszenzexperimenten sollten Fluorophore entsprechend den Anregungsquellen und Detektionskanälen des Instruments ausgewählt und spektrale Überlappungen zwischen den Markierungen möglichst minimiert werden.
Erfahren Sie mehr über Proteinmarker und Konjugate oder vergleichen Sie häufig verwendete Fluorophore in unserem Leitfaden zu Anregungs- und Emissionsmaxima.
Sekundärantikörper für Multiplex-Experimente
Multiplex-Immunfluoreszenz und -Immunhistochemie erfordern besondere Aufmerksamkeit hinsichtlich Antikörperspezifität und Kreuzreaktivität.
Wenn möglich, sollten Primärantikörper aus unterschiedlichen Wirtsspezies verwendet werden. Jeder Sekundärantikörper kann dann spezifisch eine Primärantikörperspezies erkennen. Die Sekundärantikörper sollten gegen die Spezies der jeweils anderen Primärantikörper und, falls relevant, gegen die Spezies der Probe kreuzadsorbiert sein.
Wenn mehrere monoklonale Primärantikörper derselben Spezies erforderlich sind, können unterschiedliche Immunglobulin-Subklassen teilweise mithilfe subklassenspezifischer Sekundärantikörper unterschieden werden. Sequenzielle Färbestrategien, Blocking mit Fab-Fragmenten oder direkt konjugierte Primärantikörper stellen weitere Optionen für Same-Species-Multiplex-Experimente dar.
Fluoreszenzmarker sollten außerdem eine ausreichende spektrale Trennung aufweisen, damit die einzelnen Signale zuverlässig voneinander unterschieden werden können.
Auswahl von Sekundärantikörpern nach Anwendung
| Anwendung | Häufige Detektionsstrategie | Wichtige Auswahlkriterien |
|---|---|---|
| Western Blotting | HRP-, AP- oder Fluoreszenzkonjugate | Wirtsspezies und Klasse des Primärantikörpers müssen berücksichtigt werden. Fluoreszierende Multiplex-Western-Blots erfordern spektral klar unterscheidbare Marker und geeignete Kreuzreaktivitätsprofile. |
| ELISA | HRP-, AP- oder Biotin-basierte Detektion | Berücksichtigen Sie die Klassenspezifität und mögliche Wechselwirkungen mit anderen im Assay verwendeten Antikörpern. |
| Immunfluoreszenz (IF) | Fluorophor-konjugierte Sekundärantikörper | Die Kreuzadsorption gegen die Probenspezies und gegen die Spezies anderer Primärantikörper ist insbesondere bei Multiplex-Experimenten wichtig. |
| Immunhistochemie (IHC) | Enzym- oder Fluorophor-konjugierte Antikörper | Berücksichtigen Sie endogene Immunglobuline, Fc-Rezeptoren, Probenspezies und die Kompatibilität mit Multiplex-Anwendungen. |
| Durchflusszytometrie | Fluoreszierende Sekundärantikörper | Wählen Sie Fluorophore passend zum Durchflusszytometer. Fc-Rezeptor-Blocking und/oder F(ab')2-Sekundärantikörper können bei Zellpopulationen mit hoher Fc-Rezeptor-Expression hilfreich sein. |
| Immunpräzipitation / IP-Western | Anwendungsspezifische Sekundärdetektion | Konventionelle Sekundärantikörper können die schweren und leichten Ketten des für die Immunpräzipitation verwendeten Antikörpers detektieren und dadurch Banden bei den erwarteten Molekulargewichten der IgG-Ketten erzeugen. |
Sonderfall: IP-Western Blotting
In IP-Western-Workflows können konventionelle Sekundärantikörper die denaturierten schweren und leichten Ketten des für die Immunpräzipitation verwendeten Antikörpers erkennen. Diese Signale können die Detektion von Proteinen beeinträchtigen, die bei ungefähr 50 kDa oder 25 kDa migrieren.
Spezialisierte Sekundärdetektionssysteme wie TrueBlot® wurden entwickelt, um die Detektion denaturierter Immunpräzipitationsantikörper zu reduzieren.
Den richtigen Sekundärantikörper finden
Das erste Auswahlkriterium ist in der Regel die Spezies, in der der Primärantikörper erzeugt wurde. Durchsuchen Sie unten Sekundärantikörper nach der Wirtsspezies des Primärantikörpers.
Sekundärantikörper nach Wirtsspezies des Primärantikörpers
Bei Primärantikörpern aus Hamstern sollte nach Möglichkeit bestimmt werden, ob der Antikörper aus einem Armenischen oder Syrischen Hamster stammt, da die Erkennung durch Sekundärantikörper zwischen verschiedenen Hamsterspezies möglicherweise nicht vollständig gegeben ist.
Sekundärantikörper nach Konjugat
Sekundärantikörper nach Anwendung
Immunglobulin-Isotypen
Erfahren Sie mehr über Immunglobulinklassen und Sekundärantikörper zur spezifischen Erkennung einzelner Immunglobulin-Isotypen:
