Protein Labels
Verfasst/ Bearbeitet von Julian Pampel, BScUnkonjugierte Proteine haben sich als erfolgreiche Biopharmazeutika bewährt, weisen jedoch einige Einschränkungen auf. Um Expressionsniveau, Löslichkeit, Faltung, Aufreinigung und Nachweis rekombinanter Proteine zu verbessern, ist die Konjugation mit Peptiden oder Proteinen eine häufig eingesetzte Strategie. Die meisten protein- und zellanalytischen Methoden, bei denen Antikörper eingesetzt werden, nutzen Konjugate, um den Ablauf zu verbessern oder zu vereinfachen. antibodies-online bietet konjugierte Antikörper mit einer Vielzahl kolorimetrischer und fluoreszierender Marker für Anwendungen in Detektion, Aufreinigung, Sortierung und Mikroskopie.
Wofür werden Konjugate eingesetzt?
Konjugate sind leistungsfähige Werkzeuge mit vielfältigen Einsatzmöglichkeiten. In Kombination mit einem Protein oder Peptid können sie sowohl zur Trennung als auch zum Nachweis des verwendeten Proteins oder zur Unterscheidung zwischen nativer und erhöhter Expression eingesetzt werden. Antikörperkonjugate unterstützen vor allem den Nachweis des Antikörpers und seiner Bindungspartner, können aber ebenfalls zur Trennung verwendet werden. In Immunisierungsexperimenten werden Konjugate, insbesondere KLH, häufig als Trägerproteine bei der Antikörperherstellung eingesetzt. Niedermolekulare Haptene wie Peptide, kleine Proteine und Arzneistoffmoleküle sind in der Regel nicht immunogen und benötigen ein Trägerprotein, um eine Immunantwort auszulösen.
Trennung
Für die Trennung von Proteinen können verschiedene Konjugate eingesetzt werden, die eine hohe Spezifität für eine bestimmte Matrix besitzen. Solche Konjugate bestehen häufig aus kurzen Sequenzen von 10–15 Aminosäuren und werden als Tags bezeichnet. Da diese Tags definierte Sequenzen und gut charakterisierte physikochemische Eigenschaften aufweisen, sind sie ein wichtiges Werkzeug der Molekularbiologie zur Aufreinigung rekombinanter Proteine. Epitop-Tags werden üblicherweise am N- oder C-Terminus eingefügt, um Störungen der Tertiärstruktur zu minimieren, die die Proteinfunktion verändern könnten. Bekannte Beispiele sind der GST-Tag, der His-Tag sowie die Wechselwirkung zwischen Biotin und Streptavidin.
Nachweis
Neben der Trennung ist der Nachweis und die Lokalisierung eines Antigens eine weitere wichtige Aufgabe von Tags. Die Wahl des Konjugats hängt von der jeweiligen experimentellen Anwendung ab und ermöglicht die kolorimetrische, fluoreszierende oder chemilumineszente Detektion primärer Antikörper in Zellbildgebung, Immunhistochemie, Durchflusszytometrie und Western Blot. Fluoreszenzmarkierung ist eine weit verbreitete Technik, die einen visuellen Readout ermöglicht. Nicht fluoreszierende Konjugate lassen sich in chemische und biologisch aktive Verbindungen unterteilen. Biologisch aktive Verbindungen werden häufig für die kolorimetrische Detektion von Antigenen eingesetzt, beispielsweise beim Western Blot. Dient die Immunmarkierung dazu, Informationen über isolierte Zellen oder deren Substrukturen sichtbar zu machen, spricht man von Immunzytochemie; Immunhistochemie bezeichnet im Allgemeinen Experimente, bei denen Zielstrukturen in dünnen Gewebeschnitten gefärbt werden.
Chemische Verbindungen
| Konjugat | Anwendung |
| Gold | Elektronenmikroskopie |
| Sepharose™ | Trennung bei der Immunpräzipitation (IP) |
Biologisch aktive Verbindungen
| Konjugat | Anwendung |
| APC | FACS, Elektronenmikroskopie |
| HRP | WB, ELISA, IHC |
| Glucose Oxidase | Enzymassays |
Fluoreszierende Konjugate
Ein fluoreszierender Tag markiert eine Biomolekül und ermöglicht deren Nachweis an einer bestimmten Stelle innerhalb einer Zelle, eines Gewebes oder Organs. Bei der Fluoreszenzmarkierung, häufig auch als Immunmarkierung bezeichnet, wird in der Regel ein reaktives Derivat eines fluoreszierenden Moleküls verwendet, das als Fluorophor bezeichnet wird. Fluorophore sind Moleküle, die Licht absorbieren und emittieren. Möglichkeiten zur fluoreszierenden Markierung eines Zielmoleküls umfassen Fluoreszenzfarbstoffe, Immunmarkierung und fluoreszierende Fusionsproteine. GFP und seine Varianten gehören zu den am häufigsten verwendeten Fluoreszenz-Tags.
Ein einzelner Farbstoff wird bei einer bestimmten Wellenlänge angeregt und emittiert ein Photon bei einer längeren Wellenlänge. Fluoreszenz erhöht den Kontrast und verbessert dadurch den Readout. Die Fluoreszenzdetektion basiert auf der Differenz zwischen maximaler Absorption und Emission eines Fluorophors, die als Stokes-Verschiebung bezeichnet wird. Eine große Stokes-Verschiebung bedeutet eine geringere Überlappung der beiden Wellenlängen und ist besonders vorteilhaft, da sich das emittierte Licht dadurch deutlich von der zur Anregung verwendeten Lichtquelle unterscheiden lässt. Durch die Markierung verschiedener Zielstrukturen mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarben können mehrere Strukturen oder Proteine innerhalb einer Zelle im selben Experiment visualisiert werden. Das Spektrum verfügbarer Fluoreszenz-Tags wächst kontinuierlich. Neue Alternativen bieten höhere Extinktionskoeffizienten, Quantenausbeuten oder Photostabilität und ermöglichen dadurch hellere Signale sowie verbesserte Multiplexing-Möglichkeiten.
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Fluoreszenzkonjugierte Antikörper, Kits und Proteine
| Fluorophor | Anregungsmaximum (nm) | Emissionsmaximum (nm) | Emissionsfarbe |
| DyLight 405 | 400 | 421 |  |
| Alexa Fluor 405 | 401 | 421 | |
| DyLight 350 | 352 | 435 | |
| Alexa Fluor 350 | 346 | 442 | ATTO 390 | 390 | 470 |
| Alexa Fluor 488 | 493 | 519 | |
| FITC | 492 | 520 | |
| ATTO 488 | 501 | 523 | |
| Cy3 | 550 | 570 | |
| Alexa Fluor 594 | 550 | 570 | |
| Phycoerythrin (PE) | 565 | 578 | |
| ATTO565 | 563 | 592 | |
| ATTO 594 | 591 | 616 | |
| ATTO 633 | 629 | 657 | |
| APC | 650 | 661 | |
| Alexa Fluor 647 | 651 | 667 | |
| Cy5 | 650 | 670 | |
| PerCp | 490 | 675 | |
| ATTO 655 | 633 | 684 | |
| Cy5.5 | 675 | 694 | |
| ATTO 680 | 684 | 702 | |
| Alexa Fluor 700 | 702 | 723 | |
| Cy7 | 778 | 754 | |
| DyLight 800 | 771 | 796 | |
| Alexa Fluor 790 | 784 | 814 |
Tandemfarbstoffe
Tandemfarbstoffe bieten zusätzliche Vorteile, da sie insbesondere in Mehrfarben-Panels die gleichzeitige Untersuchung einer größeren Anzahl von Markern ermöglichen. Ein Tandemfarbstoff besteht aus zwei unterschiedlichen, kovalent miteinander verbundenen Fluorophoren: einem Donor- und einem Akzeptormolekül. Befinden sich beide in unmittelbarer Nähe, wird Energie vom angeregten Donor auf das Akzeptormolekül übertragen. Dieser Prozess erfolgt über den Förster-Resonanzenergietransfer (FRET), einen Mechanismus zur Energieübertragung zwischen zwei lichtempfindlichen Molekülen.
Der Tandemfarbstoff wird bei der Anregungswellenlänge des Donormoleküls angeregt und emittiert ein Photon bei der Emissionswellenlänge des Akzeptormoleküls.
Durch den Einsatz von Tandemfarbstoffen kann ein einzelner Laser mehrere Fluorophore anregen, deren Signale von unterschiedlichen Detektoren erfasst werden. Dies erweitert die Möglichkeiten der Mehrfarben-Durchflusszytometrie erheblich; Panels mit 12 oder mehr Farben sind möglich.
Tipps für Tandemfarbstoffe
- Lichtexposition vermeiden, um Photobleaching zu reduzieren
- Nicht einfrieren, um Denaturierung zu minimieren
- Kreuzanregung zwischen Laserlinien berücksichtigen
- Nicht länger als 30 Minuten fixieren
- Hohe Chargen-zu-Chargen-Variabilität beachten
- Schmale Emissionsspektren minimieren spektrales Übersprechen
Darüber hinaus ist die Stokes-Verschiebung eines Tandemfarbstoffs größer als die des ursprünglichen Donormoleküls, wodurch sich Anregungsquelle und Emission besser voneinander unterscheiden lassen. Bei Kolokalisierungsexperimenten mit zwei unterschiedlichen Proteinen sollten sich die Emissionsspektren daher möglichst wenig überlappen. Für Mehrfarben-Immunfluoreszenzexperimente sollten Fluorophore mit schmalen Emissionsspektren verwendet werden, um spektrales Übersprechen zu minimieren. antibodies-online bietet hochwertige TR-FRET-Assay-Kits sowie sorgfältig getestete Antikörper und Arrays zur Unterstützung von Multiplex-Experimenten.
Epitop-Tags & Fusionsproteine
Protein-Tags sind Peptidsequenzen, die gentechnisch an ein rekombinantes Protein angefügt werden. Sie können spezifisch am C-Terminus, am N-Terminus oder an beiden Termini positioniert werden. Tags werden aus unterschiedlichen Gründen an Proteine angefügt und können als Affinitäts-Tags, Löslichkeits-Tags, Epitop-Tags oder Fluoreszenz-Tags dienen. Häufig werden mehrere Tags kombiniert, um Proteine mit mehreren anderen Komponenten zu verbinden. Tags können chemisch oder enzymatisch entfernt werden, beispielsweise durch Proteolyse oder Intein-Spleißen. Nachfolgend finden Sie eine umfangreiche Übersicht häufig verwendeter Tags für rekombinante Proteine und ihrer typischen Einsatzbereiche.
| Name | Sequenz | Typische Verwendung(en) * | Kommentare |
| AP Tag | 444 AA | D, Purif | Kolorimetrische Detektion; geeignet für Western Blot, Far-Western Blot, Southern Blot, Sandwich-ELISA und die subzelluläre Lokalisierung in bakteriellen und Säuger-Expressionssystemen; ermöglicht eine komfortable Aufreinigung roher periplasmatischer Extrakte aus Bakterien; die Antikörperaufreinigung liefert keine hohen Ausbeuten; Elution bei niedrigem pH-Wert kann Proteineigenschaften irreversibel beeinflussen; die Matrix ist nur begrenzt wiederverwendbar; Dimerisierung und die große Größe von AP können Eigenschaften des Fusionsproteins beeinflussen. |
| AU1 Tag | DTYRYITDFYLK | D, Purif | Wird zur Visualisierung mittels immunchemischer Methoden eingesetzt. Die erkannte AU1-Sequenz entspricht der Aminosäuresequenz DTYRYI und stammt vom Hauptkapsidprotein des bovinen Papillomavirus 1 (BPV-1). Das erkannte AU5-Epitop entspricht der Aminosäuresequenz TDFYLK. |
| AU5 Tag | DTYRYITDFYLK | D, Purif | |
| AviTag | GLNDIFEAQKIEWHE | Func, SDS, ELISA, WB | Die patentierte AviTag™-Technologie nutzt eine hochspezifische enzymatische Konjugation eines einzelnen Biotinmoleküls an einen einzigartigen Peptid-Tag aus 15 Aminosäuren in vitro oder in vivo, unter Verwendung der Biotin-Ligase BirA aus E. coli. AviTag-Fusionsproteine können mit monomerem Avidin aufgereinigt werden. Zur Visualisierung von AviTag-Fusionsproteinen können Avidin- oder Streptavidin-Konjugate in Western Blots sowie MHC-Tetramere zur Färbung und Sortierung von T-Zellen verwendet werden. |
| Biotin Ligase Tag | GLNDIFEAQKIEWH | Nachweis und Aufreinigung | Der Biotin-Ligase-Tag wird als minimale Peptidsequenz beschrieben, die als Substrat für die Biotin-Holoenzym-Synthetase BirA aus E. coli dient. In Gegenwart von aktivem BirA wird der Biotin-Ligase-Tag, auch als Biotin-Akzeptorpeptid bezeichnet, biotinyliert und ermöglicht dadurch den Nachweis oder die Aufreinigung mit Streptavidin. |
| CBP Tag | MKRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL | WB, FACS, IHC, IP, IF | Der Calmodulin-Binding-Protein-(CBP)-Affinitäts-Tag ist ein nützlicher Tag für Proteinstudien und kann mithilfe rekombinanter DNA-Technologie am N- oder C-Terminus eines Zielproteins angefügt werden. Der Tag stammt von der Myosin-Leichtketten-Kinase des Muskels. Er besteht aus 26 Aminosäureresten und besitzt eine Molekülmasse von etwa 4 kDa. Der CBP-Tag weist eine relativ hohe Affinität zu Calmodulin (CaM) auf. CBP-markierte Proteine können aus rohen Zellextrakten mithilfe einer CaM-Affinitätsmatrix aufgereinigt werden. |
| CaM Tag | KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL | WB, FACS, IHC, IP, IF | |
| FLAG® Tag | DYKDDDDK | Func, PI, WB, IP, AbP | Das FLAG® Expression System ist eine etablierte Methode zur Expression, Aufreinigung und Detektion rekombinanter Fusionsproteine. Es nutzt ein kurzes, hydrophiles Peptid aus 8 Aminosäuren, das wahrscheinlich an der Proteinoberfläche präsentiert wird. Die gute Zugänglichkeit erleichtert sowohl die Antikörperbindung als auch die Spaltung durch Enterokinase (Ek). Aufgrund seiner geringen Größe verdeckt der FLAG®-Peptid-Tag keine anderen Epitope oder Domänen und beeinflusst in der Regel weder Funktion noch Sekretion oder Transport des Fusionsproteins. Die Sensitivität kann durch Verwendung des 3x-FLAG®-Epitops erhöht werden. |
| glu-glu Tag | EYMPME | WB, ELISA, ICC/IF, IP, Purif | Der glu-glu-Epitop-Tag wird üblicherweise am N- oder C-Terminus eines Zielproteins eingefügt, sodass das markierte Protein mit immunchemischen Methoden analysiert und visualisiert werden kann. Das erkannte glu-glu-Epitop entspricht den Aminosäureresten 314–319 (EYMPME) des Middle-T-Antigens des Maus-Polyomavirus. |
| GST Tag | Fusionsprotein, 220 AA | AP | GST (Glutathion-S-Transferase) bindet an immobilisiertes Glutathion. Der GST-Tag wird häufig am N- oder C-Terminus eines Zielproteins angefügt, um Fusionsproteine zu erzeugen, die mithilfe eines Pull-down-Assays aufgereinigt sowie über die Eigenschaften des GST-Tags visualisiert und analysiert werden können. |
| HA Tag | YPYDVPDYA | SDS, IHC, WB, ELISA | Der HA-(humanes Influenza-Hämagglutinin)-Epitop-Tag basiert auf einem Oberflächenglykoprotein, das für die Infektiosität des humanen Influenzavirus erforderlich ist. Der HA-Tag wird aus dem HA-Molekül abgeleitet und entspricht den Aminosäuren 98–106. Er scheint die Bioaktivität oder Biodistribution des rekombinanten Proteins nicht zu beeinträchtigen und erleichtert dessen Nachweis, Isolierung und Aufreinigung. Das erkannte HA-Epitop entspricht der Aminosäuresequenz YPYDVPDYA. |
| HAT Tag | KDHLIHNVHKEFHAHAHNK | Purif | Das HAT-(Histidin-Affinitäts-Tag)-Epitop ist eine natürlich vorkommende Sequenz nicht benachbarter Histidinreste und weist eine geringere Gesamtladung auf als Tags mit aufeinanderfolgenden His-Resten. |
| His Tag | HHHHHH | SDS, WB, Crys, Func | Polyhistidin-Tags eignen sich für den Nachweis und die Analyse exprimierter rekombinanter Proteine mittels Immunoblotting, Immunpräzipitation und Immunfärbung. |
| Myc Tag | EQKLISEEDL | FACS, IAC, IA, IHC, WB | Das c-Myc-Protein ist ein Transkriptionsfaktor, der vom c-Myc-Gen auf dem menschlichen Chromosom 8q24 kodiert wird. c-Myc ist in zahlreichen Tumorzellen aktiviert und spielt eine wichtige Rolle bei Zellproliferation, Differenzierung, Apoptose und Zellzyklusprogression. Als Immunogen wird ein synthetisches Peptid verwendet, das den Resten 410–419 des humanen p62-c-Myc-Proteins entspricht und an KLH konjugiert ist. Der c-Myc-Tag ermöglicht die Lokalisierung von Genprodukten in verschiedenen Zelltypen, die Untersuchung der Topologie von Proteinen und Proteinkomplexen sowie die Identifizierung assoziierter Proteine. Es wird empfohlen, den Tag nicht direkt hinter dem Signalpeptid eines sekretorischen Proteins einzufügen, da dies die Translokation in den sekretorischen Weg beeinträchtigen kann. |
| Rho Tag | MNGTEGPNFYVPFNSNKTGVV | Func, WB, IP, AbP | Der Rho-Tag ist ein Epitop-Tag aus einem Peptid mit zwanzig Aminosäureresten, MNGTEGPNFYVPFSNKTGVV, das von den ersten 20 Aminosäuren des bovinen Rhodopsins abgeleitet ist. Der Rho-Tag kann verwendet werden, um das Expressionsniveau bestimmter eukaryotischer Membranproteine zu erhöhen oder deren hochspezifische Aufreinigung zu ermöglichen. |
| SNAP-Tag® | Fusionsprotein (20 kDa) | SNAP- und CLIP-Tag-Proteinmarkierungssysteme® ermöglichen die spezifische, kovalente Kopplung nahezu jedes Moleküls an ein Zielprotein. Das System wird in zwei Schritten eingesetzt: Zunächst wird das Zielprotein als SNAP-tag®-Fusion kloniert und exprimiert, anschließend wird die Fusion mit einem ausgewählten SNAP-tag®-Substrat markiert. SNAP-tag® ist ein kleines Protein, das auf der humanen O6-Alkylguanin-DNA-Alkyltransferase (hAGT), einem DNA-Reparaturprotein, basiert. SNAP-tag®-Substrate sind Farbstoffe, Fluorophore, Biotin oder Beads, die über einen Benzyl-Linker an Guanin- oder Chlorpyrimidin-Abgangsgruppen gekoppelt sind. Während der Markierungsreaktion wird die substituierte Benzylgruppe des Substrats kovalent an SNAP-tag® gebunden. CLIP-tag™ ist eine modifizierte Variante von SNAP-tag®, die so entwickelt wurde, dass sie mit Benzylcytosin- statt mit Benzylguanin-Derivaten reagiert. In Kombination mit SNAP-tag® ermöglicht CLIP-tag™ die orthogonale und komplementäre Markierung zweier Proteine gleichzeitig in denselben Zellen. | |
| CLIP-Tag™ | Fusionsprotein | ||
| Strep Tag II® | SA-WSHPQFEK | WB, IF, IP | Das Strep-tag-System® ermöglicht die Aufreinigung und Detektion von Proteinen mittels Affinitätschromatographie. Strep-tag® ist ein synthetisches Peptid aus acht Aminosäuren (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys). Diese Peptidsequenz besitzt eine intrinsische Affinität zu Strep-Tactin®, einem speziell entwickelten Streptavidin, und kann am N- oder C-Terminus rekombinanter Proteine fusioniert werden. Durch die hochspezifische Wechselwirkung können Strep-markierte Proteine in einem Schritt aus rohen Zelllysaten isoliert werden. Da Strep-tag® unter milden, physiologischen Bedingungen eluiert werden kann, eignet es sich besonders zur Herstellung funktioneller Proteine. |
| Twin-Strep Tag® | SA- WSHPQFEK (GGGS)2GGSA WSHPQFEK | WB | Ein Tandem-Strep-tag®, früher als One-STrEP-tag® bezeichnet, für die schonende und schnelle Aufreinigung intakter Proteinkomplexe an immobilisiertem Strep-Tactin®. |
| T7 Tag | MASMTGGQQMG | WB, SDS, IP, MS | Der T7-Epitop-Tag wird üblicherweise am N- oder C-Terminus eines Zielproteins eingefügt, sodass das markierte Protein mithilfe immunchemischer Methoden analysiert und visualisiert werden kann. Das erkannte T7-Epitop entspricht der Aminosäuresequenz MASMTGGQQMG und stammt vom Hauptkapsidprotein des T7-Gens. |
| Trx Tag | Fusionsprotein | SDS, WB, MS, Func | Der Thioredoxin-(TRX)-Tag wird vor allem verwendet, um die Löslichkeit und thermische Stabilität von Proteinen zu erhöhen, die in bakteriellen Systemen exprimiert werden. Zudem unterstützt er die Rückfaltung von Proteinen, die eine reduzierende Umgebung benötigen. Er kann außerdem als Epitop-Tag verwendet werden und besitzt eine Molekülmasse von etwa 12 kDa. |
| V5 Tag | GKPIPNPLLGLDST oder IPNPLLGLD | WB, IF, IP | Kleines Epitop (Pk), das auf den P- und V-Proteinen des Paramyxovirus Simian Virus 5 (SV5) vorkommt. Der V5-Epitop-Tag wird üblicherweise am N- oder C-Terminus eines Zielproteins eingefügt, sodass das markierte Protein mithilfe immunchemischer Methoden analysiert und visualisiert werden kann. Das erkannte V5-Epitop entspricht den Aminosäureresten 95–108, GKPIPNPLLGLDST, der Alpha-Untereinheit der RNA-Polymerase von Simian Virus 5. |
Abkürzungen: Affinitätsaufreinigung (AP), Antikörperherstellung (AbP), Durchflusszytometrie (FACS), funktionelle Studien (Func), Kristallisation (Chrys), Detektion (D), Immunzytochemie (ICC), Immunfluoreszenz (IF), Immunhistochemie (IHC), Immunpräzipitation (IP), Immunoassay (IA), Massenspektrometrie (MS), Proteininteraktion (PI), Proximity Ligation Assay (PLA), Aufreinigung (Purif), Trennung (Sep), SDS-PAGE (SDS), Western Blot (WB)
Creative mind of antibodies-online with a keen eye for details. Proficient in the field of life-science with a passion for plant biotechnology and clinical study design. Responsible for illustrated and written content at antibodies-online as well as supervision of the antibodies-online scholarship program.
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