Protein Expressions Systeme

Die Herstellung funktioneller Proteine ist ein entscheidender Schritt, um die Funktion und Struktur von Proteinen von Interesse zu untersuchen. Darüber hinaus werden rekombinante Enzyme in der Lebensmittel- und Chemieindustrie eingesetzt, während hochwertige Proteine für diagnostische, therapeutische und pharmazeutische Anwendungen benötigt werden. Die chemische Synthese ist nicht ausreichend entwickelt, um komplexe Proteinstrukturen korrekt herzustellen. Stattdessen werden lebende Organismen so verändert, dass sie auf Grundlage bereitgestellter genetischer Informationen in Form von DNA Proteine produzieren. Die Struktur der DNA ist einfach genug, um DNA-Templates mit gewünschten kodierten Funktionen wie zusätzlichen Reporter- oder Affinitäts-Tag-Sequenzen zu konstruieren. Proteine, die anhand künstlicher Templates erzeugt werden, werden als rekombinante Proteine bezeichnet. Dieser Artikel stellt die Vor- und Nachteile mikrobieller und säugerzellbasierter sowie zellfreier pflanzenbasierter Systeme zur rekombinanten Proteinexpression gegenüber.

Rekombinante Proteinexpression

Das erste etablierte Protokoll zur rekombinanten Proteinexpression nutzt die Transfektion von Wirtszellen mit einem DNA-Vektor, der das gewünschte Template enthält, und die anschließende Vermehrung der Zellen. Die Transkriptions- und Translationsmaschinerie der Wirtszellen produziert zahlreiche Kopien des Zielproteins, die nach Zelllyse und anschließender Aufreinigung gewonnen werden können.

Seitdem wurden zahlreiche Expressionssysteme und Protokolle entwickelt. Sowohl prokaryotische als auch eukaryotische in vivo Proteinexpressionssysteme sind weit verbreitet. Proteintyp, Anforderungen an die funktionelle Aktivität und die gewünschte Ausbeute beeinflussen die Wahl des Systems. Ob Bakterien, Hefe, Insekten-, Säuger- oder Pflanzenzellen – jedes System besitzt eigene Vorteile und Herausforderungen. Die Auswahl des geeigneten Systems für die jeweilige Anwendung ist daher entscheidend für eine erfolgreiche rekombinante Proteinexpression. Die folgende Tabelle gibt einen Überblick über Vorteile und Herausforderungen verschiedener Proteinexpressionssysteme.

Vergleich von Proteinexpressionssystemen

Posttranslationale Modifikationen

Nach der Translation werden Proteine als letzter Reifungsschritt auf unterschiedliche Weise modifiziert, um ihre Struktur zu vervollständigen, ihren zellulären Bestimmungsort festzulegen oder ihre Aktivität innerhalb der Zelle zu regulieren. Posttranslationale Modifikationen (PTMs) umfassen verschiedene Ergänzungen oder Veränderungen der chemischen Struktur und sind entscheidende Elemente der Zellbiologie. Dazu gehören beispielsweise die Entfernung von Proteinsegmenten durch Peptidasen, die Addition von Phosphat-, Zucker- oder Lipidgruppen an bestimmte Aminosäuren sowie Glykosylierungen. PTMs können an Aminosäureseitenketten oder am C- beziehungsweise N-Terminus des Proteins auftreten.

Nach der Proteinsynthese werden Disulfidbrücken gebildet und das Protein faltet sich in seine dreidimensionale Struktur. Die einfachste dieser Modifikationen ist die Entfernung des N-terminalen Methioninrests, die in allen Organismen auftreten kann. Die Methioninabspaltung wird auf verschiedenen Ebenen reguliert und spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des Proteinumsatzes, also des Gleichgewichts zwischen Proteinsynthese und Proteinabbau.

Signalpeptide sind 20 bis 100 Aminosäuren lange Sequenzen, die überwiegend am N-Terminus eines Proteins lokalisiert sind. Die Eigenschaften ihrer Aminosäuren bestimmen wesentlich die Interaktion mit dem Proteintransportsystem und damit den Bestimmungsort, an den das Protein transportiert wird. Proteine ohne entsprechende Signalsequenz verbleiben im Zytoplasma. Verschiedene Signalsequenzen können kombiniert werden und dadurch ein duales Targeting von Proteinen in zwei Kompartimente ermöglichen. Signalsequenzen und Transportprozesse unterscheiden sich zwischen den Organismenreichen. Dies stellt eine Herausforderung bei der rekombinanten Expression funktioneller Proteine dar.

Glykosylierung

Ähnlich dazu werden komplexere Modifikationen wie N- und O-Glykosylierung sowie Phosphorylierung ausschließlich von eukaryotischen Zellen durchgeführt. Zusammen mit Nitrosylierung, GTP-Bindung und Histonacetylierung regulieren sie Funktion und Expression von Proteinen. Prenylierung unterstützt die Membranlokalisation von Proteinen.

Die Art der N-verknüpften Glykane eines Glykoproteins wird sowohl durch das Protein als auch durch die Zelle bestimmt, in der es exprimiert wird. Eukaryotische Expressionswirte wie Hefen und tierische Zellen weisen unterschiedliche Glykosylierungsmuster auf. Während die Glykosylierung in Hefe typischerweise einen hohen Mannoseanteil besitzt, sind die Muster von Insektenzellen vergleichsweise einfach und enthalten keine Sialinsäure. Tierische und menschliche Zellen ähneln sich stärker, zeigen jedoch ebenfalls erhebliche Variationen. Ihre Muster sind komplexer und können unter anderem Galactose, Sialinsäure und Fucose enthalten. Die Glykosylierungsmuster unterscheiden sich zudem zwischen Spezies, die jeweils unterschiedliche Typen N-verknüpfter Glykane synthetisieren.

Glykosylierungsmuster sind an der Zellmigration beteiligt und sowohl für Struktur als auch Funktion eines Proteins von Bedeutung. Sie können die Proteinfaltung fördern und die Stabilität erhöhen. Immunglobuline wie IgE, IgM oder IgG nutzen Glykosylierungen; Veränderungen der Affinität zu Fc- und anderen Immunrezeptoren können spezifische Effektorfunktionen erzeugen. Dies ist insbesondere für den wachsenden Markt rekombinanter therapeutischer monoklonaler Antikörper wie

Infliximab

und

Rituximab

relevant. Solche feinen Unterschiede sind von großer Bedeutung, da sie potenziell immunogene Reaktionen auslösen können. Chinese-Hamster-Ovary-(CHO) Zellen haben sich als Standardzelllinie für biologische und medizinische Forschung sowie kommerziell für die Herstellung therapeutischer Proteine etabliert. Ihre Glykosylierungsmuster stimmen in hohem Maße mit denen menschlicher Zellen überein. Dennoch können sich die in diesen Systemen produzierten Glykane von menschlichen Glykanen unterscheiden, da sie sowohl mit N-Glycolylneuraminsäure (Neu5Gc) als auch mit N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac) abgeschlossen werden können, während menschliche Zellen nur Glykoproteine mit N-Acetylneuraminsäure produzieren. Darüber hinaus können Galactose-alpha-1,3-Galactose-Epitope aus in tierischen Zellen produzierten Glykoproteinen schwere anaphylaktische Reaktionen auslösen. Forschende versuchen daher, diese Systeme durch genetische Knockouts oder Überexpression so zu optimieren, dass die Stoffwechselwege zur Bildung solcher Glykanstrukturen eliminiert werden.

Prüfen Sie Tabelle 2 um herauszufinden, welches Expressionssystem die von Ihnen benötigten PTMs ermöglicht.

Bakterielle Proteinexpression

Bakterielle Proteinexpressionssysteme werden häufig für die rekombinante Proteinproduktion eingesetzt, insbesondere im größeren Maßstab. Einfache Kulturbedingungen sowie das schnelle und unkomplizierte Wachstum von Bakterien ermöglichen eine hohe Skalierbarkeit bei gleichzeitig niedrigen Produktionskosten.

Das System liefert für die meisten Anwendungen wie Antikörperherstellung, funktionelle Assays und Proteininteraktionsstudien eine ausreichende Qualität. In Bakterien exprimierte eukaryotische Proteine sind jedoch häufig nicht funktionell, da bakterielle Zellen nicht über die für erforderliche PTMs oder Faltungsschritte notwendige Maschinerie verfügen. Qualitätsprobleme bei der bakteriellen Proteinexpression treten typischerweise bei großen Proteinen (> 50 kDa), komplexen Proteinstrukturen mit mehreren Domänen sowie Transmembransegmenten auf, die mehrere Signalpeptide und PTMs wie Disulfidbrücken oder Glykosylierungen benötigen.

Ein weiteres Hindernis ist die Aggregation rekombinanter Proteine mit Disulfidbrücken in E. coli in sogenannten Inclusion Bodies. E. colihält sein Zytoplasma in einem reduzierenden Zustand, der die Bildung stabiler Disulfidbrücken in Proteinen stark erschwert.

Die Aggregation ist eine direkte Folge der fehlenden Bildung von Disulfidbrücken. 70–80 % der in E. coli exprimierten rekombinanten Proteine befinden sich in Inclusion Bodies. Die Aufreinigung ist zeitaufwendig und erfordert üblicherweise zwei wesentliche Schritte: die Extraktion der Inclusion Bodies aus den Bakterien und anschließend die Solubilisierung der aufgereinigten Inclusion Bodies.

Proteinexpression in Insektenzellen

Zur Herstellung großer Mengen eines funktionellen rekombinanten Proteins greifen viele Forschende auf Baculovirus-Expressionssystemezurück. Im Vergleich zu bakteriellen Systemen ähnelt die Proteinexpression in Insektenzellen stärker den Prozessen in Säugerzellen. Daher eignen sich diese Systeme besonders für Proteine, die aufgrund ihrer Größe, Komplexität oder Anforderungen an die posttranslationale Prozessierung nur schwer in Bakterien exprimiert werden können. Die Systeme lassen sich vergleichsweise einfach skalieren und für hochdichte Suspensionskulturen zur Produktion im großen Maßstab anpassen.

Unter den eukaryotischen Expressionssystemen hat die Plattform mit Baculovirus-infizierten Insektenzellen besondere Aufmerksamkeit erhalten, wodurch verschiedene Strategien zur Proteinexpression entwickelt und etabliert wurden. Dabei wird die Fähigkeit von Baculoviren genutzt, Gene in ihre Zielzellen einzubringen und die Expression des entsprechenden Proteins zu induzieren. Die am häufigsten für Proteinexpressionsstudien verwendete Baculovirus-Spezies ist

Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV)

.

Zahlreiche Insektenzellen, etwa aus Fruchtfliegen, Mücken und Seidenraupen, wurden zu Zelllinien weiterentwickelt. Im Laufe der Zeit hat sich Gewebe der Kohlschabe (Trichoplusia ni) als bevorzugte Zelllinie etabliert. Besonders vorteilhaft sind die hohe Wachstumsrate und die geringere Abhängigkeit von Insektenhämolymphe im Kulturmedium. Die Trichoplusia-ni Zelllinie High Five (offiziell BTI-Tn-5B1-4) exprimiert kontinuierlich 5- bis 10-mal mehr rekombinantes Protein als andere Lepidopteren-Zelllinien wie Sf9-Zellen. Sie kann serumfrei kultiviert werden, was die Produktionskosten erheblich reduziert, und sowohl locker adhärent als auch in Suspension wachsen.

Für die Expression in Insektenzellen wurden zwei Ansätze entwickelt: sekretierte und extrazelluläreExpression. Die Wahl des Expressionswegs eines bestimmten Proteins richtet sich nach seiner zellulären Lokalisation im nativen Zustand. Proteine, die extrazellulär funktionieren werden als sekretierte Proteine exprimiert und aus dem Kulturmedium gewonnen. Für die sekretierte Expression muss ein Signalpeptid zusammen mit einem (His)-Tag, einer TEV-Protease-Erkennungsstelle und dem gewünschten Gen genetisch in das Konstrukt integriert werden. Proteine hingegen, die im Zellkern oder im Zytoplasma funktionieren, werden intrazellulärexprimiert.

Nachteile der rekombinanten Proteinproduktion in Insektenexpressionssystemen sind lange Produktionszeiten und vergleichsweise hohe Kosten. Vergleichen Sie die Vor- und Nachteile verschiedener Proteinexpressionssysteme auf einen Blickoder entdecken Sie unser breites Angebot hochwertiger rekombinanter Proteine, die in Insektenzellen exprimiert und bei antibodies-online erhältlich sind.

Proteinexpression in Säugerzellen

Obwohl zahlreiche Säugerproteine erfolgreich in Bakterien, Hefe oder Insektenzellen produziert werden können, steigt die Nachfrage nach Säugerzellkulturen. Proteine in geeigneter Menge und Qualität sind heute für viele Anwendungen unerlässlich. Expressionssysteme auf Basis von Säugerzellen können eine korrekte Proteinfaltung, posttranslationale Modifikationen und den richtigen Zusammenbau von Proteinprodukten ermöglichen – alles wichtige Voraussetzungen für eine vollständige funktionelle Aktivität. Diese Vorteile gehen jedoch mit anspruchsvolleren Kulturbedingungen und hohen Produktionskosteneinher.

Die Proteinexpression in Säugerzellen kann durch transiente Plasmidtransfektion, Etablierung stabiler Zelllinien, Retrovirus- oder Lentivirus-Transduktion oder Transfektion modifizierter mRNA erreicht werden.

Säugerexpressionssysteme können für transiente oder stabile Zelllinien eingesetzt werden, wobei bei stabilen Systemen das Expressionskonstrukt in das Wirtsgenom integriert wird. Während stabile Zelllinien über mehrere Experimentehinweg verwendet werden können, ermöglicht die transiente Produktion die Herstellung großer Proteinmengen innerhalb von ein bis zwei Wochen. Hierfür werden Suspensionskulturen eingesetzt, die Ausbeuten im Grammbereich pro Liter erreichen können, während konventionelle Säugerzelllinien typischerweise langsam wachsen und geringere Expressionsniveaus aufweisen.

Pflanzliche Proteinexpression

Die transiente Proteinexpression in Pflanzen hat sich zu einer vielversprechenden Plattform für die Herstellung verschiedenster Impfstoffe, therapeutischer Proteine, Enzyme und Antikörper entwickelt. Pflanzenbasierte Expressionssysteme bieten mehrere potenzielle Vorteile, darunter Sicherheit und Kosteneffizienz bei der Herstellung biologisch aktiver Produkte. Darüber hinaus ermöglichen diese Systeme eukaryotische PTMs und können dadurch die Funktionalität exprimierter Proteine verbessern. Dies ist insbesondere für therapeutische Proteine und humane Enzyme von Bedeutung.

Die zellfreie Proteinexpression (CFPE) ist eine Methode zur Proteinproduktion, bei der die RNA- und Proteinsynthesemaschinerie von Zellen in einem System ohne Zellmembranen und funktionelles Genom genutzt wird. Dieser in vitro Ansatz ermöglicht die flexible Expression einer Vielzahl von Proteinen unter unterschiedlichen Bedingungen. Ein besonderer Vorteil der zellfreien Proteinexpression liegt darin, dass auch Proteine hergestellt werden können, deren Expression in lebenden Zellen schwierig oder nicht möglich ist, insbesondere wenn sie toxische Effekte verursachen. Obwohl solche Proteine mit zellbasierten Expressionsmethoden nur eingeschränkt kompatibel sind, dienen sie häufig als Wirkstoffziele oder besitzen Potenzial als therapeutische Wirkstoffe.

ALiCE® (Almost Living Cell-Free Expression) ist eine eukaryotische Proteinexpressionsplattform, mit der Proteine in größerem Maßstab hergestellt werden können. Das System kombiniert die Vorteile von Nicotiana. Tabacum als pflanzliches Expressionssystem mit der schnellen Expression durch CFPE. ALiCE® erreicht innerhalb von nur 48 Stunden durchschnittliche Proteinausbeuten von etwa 2 Gramm pro Liter. Für industrielle Anwendungen kann das Volumen auf bis zu 10 Liter skaliert werden. Darüber hinaus kann ALiCE® eukaryotische PTMs wie komplexe Glykosylierungsmuster an Proteinen erzeugen.