Nanodiscs

Nanodiscs sind künstliche Gerüststrukturen, die die Phospholipid-Doppelschicht nachbilden, welche jede lebende Zelle umgibt. Sie ermöglichen die Rekonstitution und Stabilisierung von Membranproteinen (MPs) in nativer Konformation und damit funktionelle Untersuchungen dieser wichtigen Wirkstofftargets. Nanodiscs könnten außerdem den Weg für den Einsatz von Membranproteinen in zukünftigen diagnostischen Assays ebnen.

Was sind Nanodiscs?

Warum Nanodiscs verwenden?

Nanodiscs sind nicht die einzige Möglichkeit, korrekt gefaltete und aktive Membranproteine zu untersuchen. Gegenüber häufig eingesetzten Methoden bieten sie jedoch mehrere Vorteile:

Scaffold-Protein-Varianten

Die am häufigsten verwendete Nanodisc-Scaffold-Protein-Variante ist MSP1D1. Das Protein umfasst zehn α-Helices ähnlich Apo A-I, besitzt jedoch einen modifizierten N-Terminus und sorgt im Vergleich zum ursprünglichen MSP1 für eine höhere Stabilität des assemblierten Nanodiscs. MSP1D1-deltaH5 entspricht MSP1D1 mit Ausnahme einer Deletion von Helix 5. Dadurch entsteht ein Nanodisc-Komplex mit kleinerem Durchmesser, der sich beispielsweise besser für NMR-Studien eignet. MSP1E3D1 wurde dagegen durch die Duplikation von drei Helices verlängert, während MSP2N2 einem vollständigen MSP1D1 entspricht, das über einen kurzen Linker mit einem verkürzten MSP1D2-Protein fusioniert ist. Diese verlängerten Varianten ermöglichen Nanodiscs mit größerem Durchmesser und eignen sich zur Einlagerung größerer Proteinkomplexe.

Assemblierung von MSP-Nanodiscs

Nanodiscs assemblieren sich nach Entfernung des Detergenzes selbstständig aus einer Mischung aus MSPs, Phospholipiden und Detergenz. Das optimale Verhältnis von Phospholipiden zu MSP ist ein kritischer Parameter, um eine vollständige Selbstassemblierung und homogen große Nanodiscs zu gewährleisten. Dieses Verhältnis hängt sowohl vom verwendeten MSP als auch vom Phospholipid ab. Durch eine sorgfältige Kontrolle des molaren Verhältnisses zwischen Zielprotein, MSP und Lipiden können außerdem Nanodiscs mit unterschiedlichen Oligomerisierungszuständen des Membranproteins assembliert werden (5).

Aufgereinigte Membranproteine werden nach Zugabe von MSPs und Phospholipiden sowie Entfernung des Detergenzes spontan rekonstituiert. Bei membrangebundenen Proteinen können die nativen Membranphospholipide nach der Assemblierung ebenfalls die Doppelschicht des Nanodiscs bilden, die das Protein umgibt. Das Vorhandensein nativer Phospholipide kann sich positiv auf Proteinaktivität und -struktur auswirken. Zudem ist die Expositionszeit des solubilisierten Proteins gegenüber Detergenzien deutlich kürzer.

Phospholipide

Die Phospholipid-Doppelschicht im Nanodisc kann aus unterschiedlichen Phospholipiden oder Phospholipidgemischen zusammengesetzt werden, um optimale Bedingungen für das jeweilige Zielprotein zu schaffen. Die Lipidauswahl hängt stark vom Protein ab und kann dessen Aktivität erheblich beeinflussen. Darüber hinaus benötigen Proteine verschiedener Spezies unterschiedliche Phospholipidumgebungen: Ein humanes Membranprotein benötigt beispielsweise typischerweise eine andere Lipidumgebung als ein bakterielles Membranprotein. Daher empfiehlt es sich, verschiedene Phospholipide zu testen.

Häufig verwendete Phospholipide sind Palmitoyl-Oleoyl-Phosphatidylcholin (POPC), Dimyristoyl-Glycero-Phosphocholin (DMPC), Dimyristoyl-Phosphatidylglycerol (DMPG) und 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DPPC). Darüber hinaus steht eine große Vielfalt weiterer Phospholipide zur Verfügung, um die Eigenschaften des jeweiligen Zielproteins möglichst optimal abzubilden.

Synthetische Nanodiscs

Im Gegensatz zu MSP-Nanodiscs werden synthetische Nanodiscs mithilfe synthetischer Polymere gebildet, typischerweise Styrol-Maleinsäure-Copolymere (SMA) und Diisobutylen-Maleinsäure (DIBMA). Jedes Polymer besitzt spezifische Vorteile und Einschränkungen. DIBMA absorbiert beispielsweise kein Licht bei 280 nm und eignet sich daher besonders für Proteinanalysen mit spektroskopischen Methoden. Die Assemblierung synthetischer Nanodiscs beginnt mit intakten Zellen. Lange Polymerketten integrieren sich dabei um die Ziel-Membranproteine in die Zellmembran. Dadurch werden die Membranproteine aus der Membran herausgelöst und in der Polymerlösung solubilisiert. Die Polymer-Protein-Interaktion stabilisiert die Membranproteine innerhalb der neu gebildeten Nanodiscs. Synthetische Polymere bieten damit eine hohe Flexibilität und Kontrolle bei der Stabilisierung und Analyse von Membranproteinen und ermöglichen stabile, funktionelle Nanodiscs für zahlreiche biochemische und biophysikalische Forschungsanwendungen.

Verfügbare Varianten synthetischer Nanodiscs

antibodies-online bietet verschiedene synthetische Nanodiscs an. Anders als viele MSP-Nanodiscs können unsere synthetischen Nanodiscs direkt aus Zellen hergestellt werden. Die dabei eingesetzten Polymere erfüllen zwei Funktionen: Sie lösen die Zellmembran ähnlich einem Detergenz auf und nutzen gleichzeitig die zellulären Phospholipide, um Nanodiscs um die Membranproteine zu bilden. Die Nanodiscs mit eingebettetem Zielprotein können anschließend aufgereinigt werden.

Welcher Nanodisc-Typ für welches Protein?

Obwohl sowohl MSP- als auch synthetische Nanodiscs die Solubilisierung und Stabilisierung von Membranproteinen ermöglichen sollen, unterscheiden sie sich in wichtigen Eigenschaften. Diese Unterschiede bestimmen die jeweils geeigneten Einsatzbereiche. Die folgende Tabelle vergleicht beide Varianten und hilft bei der Auswahl des passenden Nanodisc-Typs für die jeweilige Anwendung.

MSP-Nanodiscs besitzen eine einheitliche Größe und eignen sich daher besonders für Anwendungen wie Kryo-EM. Polymerbasierte Nanodiscs können dagegen ein zusätzliches Screening erfordern, da der Durchmesser der verwendeten Polymere variieren kann.

Eine wesentliche Herausforderung bei MSP-Nanodiscs ist die mögliche Interferenz durch das MSP-Protein selbst. Die Konzentration des Zielproteins lässt sich nicht ohne Weiteres über die Absorption bei 280 nm bestimmen, und MSP kann in Assays zusammen mit dem Zielprotein zusätzlichen Hintergrund verursachen.

Bei MSP-Nanodiscs werden außerdem Detergenzien zur Auflösung der Zellmembran eingesetzt. Daher ist die Auswahl eines Detergenzes wichtig, das die Faltung des Zielproteins nicht beeinträchtigt. Synthetische Nanodiscs benötigen dagegen keine Detergenzien, da die eingesetzten Polymere sowohl als Solubilisatoren als auch als Stabilisatoren dienen. Im folgenden Abschnitt finden Sie Beispiele für den Einsatz von Nanodiscs in unterschiedlichen Anwendungen.

Anwendungen

Nanodiscs eignen sich für Anwendungen, bei denen Membranproteine in ihrem nativen Zustand innerhalb eines Modellmembransystems benötigt werden. Die folgende Tabelle zeigt Beispiele für Publikationen, in denen Nanodiscs zur Untersuchung verschiedener Proteine in unterschiedlichen Anwendungen eingesetzt wurden.