Basisprotokoll für die Durchflusszytometrie

Die Durchflusszytometrie zählt zu den vielseitigsten Methoden zur Analyse zellulärer Eigenschaften auf Einzelzellebene. Sie erlaubt die Quantifizierung von Oberflächen- und intrazellulären Markern, die Bewertung der Zellvitalität und die Untersuchung heterogener Zellpopulationen. Das folgende Protokoll dient als allgemeiner Leitfaden und kann flexibel an spezifische experimentelle Anforderungen angepasst werden.

Materialien und Reagenzien

Puffer und Lösungen

• PBS (phosphatgepufferte Salzlösung), pH 7,2–7,4
• Färbepuffer: PBS mit 1–2 % BSA oder FBS; optional 0,05–0,1 % Natriumazid
• Fixativ: 1–4 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS
• Permeabilisierungspuffer: 0,1 % Saponin oder 0,1 % Triton X-100
• Viability Dye (optional, jedoch empfohlen)

Biologisches Material

• Suspensionszellen oder adhärente Zelllinien
• Primärzellen, z. B. periphere Blutmononukleäre Zellen (PBMCs)

Antikörper

• Fluorophor-konjugierte Primärantikörper
• Optional unkonjugierte Antikörper mit entsprechenden Sekundärantikörpern oder F(ab')₂-Fragmenten

Vorbereitung der Zellen

• Empfohlene Zellzahl: 1–5 × 10⁵ Zellen pro Ansatz
• Zellen ernten und einmal mit Färbepuffer waschen
• Zellpellet in 100–200 µL Färbepuffer resuspendieren
• Bei primären Immunzellen: Fc-Rezeptorblockade zur Reduktion unspezifischer Bindungen einsetzen

Viability-Färbung (optional, empfohlen)

• Verbessert die Datenqualität durch Ausschluss toter Zellen
• 15 min Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln
• Anschließend kurzer Waschschritt mit Färbepuffer

Färbung von Oberflächenantigenen

• Zellsuspension auf das gewünschte Volumen einstellen
• Fluorophor-konjugierten Antikörper direkt hinzufügen
• 30 min bei 4 °C im Dunkeln inkubieren
• Zellen waschen und erneut resuspendieren
• Antikörperkonzentration im Vorfeld titrieren, um optimale Signale zu gewährleisten

Fixierung

• Optional bei reiner Oberflächenfärbung, jedoch erforderlich für intrazelluläre Targets oder verzögerte Messungen
• 10–15 min Inkubation mit 1–4 % PFA
• Fixierung durch Waschschritt mit Puffer abschließen

Intrazelluläre Färbung

• Zellen mit Saponin oder Triton X-100 permeabilisieren
• Antikörper hinzufügen und 30–45 min bei RT oder 4 °C inkubieren
• Zellen mit permeabilisierungskompatiblem Puffer waschen
• Resuspension in einem geeigneten Puffer für die Analyse

Vorbereitung für die Analyse

• Proben filtrieren, um Zellaggregate zu entfernen
• Erforderliche Kontrollen einsetzen:
  • Einzelfarbstoffkontrollen
  • FMO-Kontrollen
  • Isotypkontrollen (optional)
• Endvolumen pro Probe: 200–500 µL

Durchführung und Datenauswertung

Messung:

• Einstellungen des Geräts anhand geeigneter Referenzproben definieren
• Typischer Messbereich: 10⁴–10⁵ Ereignisse pro Probe
• Korrekte Kompensation der Fluorophorspektren sicherstellen

Auswertung:

• Gating auf intakte Zellen mittels FSC/SSC
• Ausschluss von Zelltrümmern und Doppeltsignalen
• Vitalitäts-Gating bei Nutzung eines Viability Dyes
• Analyse der Expressionsmuster der Zielmarker

Hinweise zur Optimierung

• Antikörpertitration zur Optimierung von Sensitivität und Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis
• FMO-Kontrollen bei komplexen Multiparameterpanels unbedingt einplanen
• Viability-Färbungen grundsätzlich zur Qualitätssteigerung verwenden
• Fluorophor- und Panel-Design unter Berücksichtigung spektraler Überlappungen planen