Antibody Validation: Knockout and Knockdown Validated Antibodies

Eine zuverlässige Antikörperleistung ist entscheidend für reproduzierbare Forschung in den Lebenswissenschaften. Ein Antikörper kann ein starkes Signal erzeugen und dennoch unbeabsichtigte Proteine detektieren oder anwendungsabhängigen Hintergrund verursachen. Ziel der Antikörpervalidierung ist es daher, experimentelle Evidenz dafür bereitzustellen, dass das beobachtete Signal unter definierten Versuchsbedingungen mit dem beabsichtigten Zielprotein zusammenhängt.

Zur Beurteilung der Antikörperspezifität können verschiedene komplementäre Strategien eingesetzt werden. Zu den direktesten Ansätzen gehören genetische Validierungsmethoden, bei denen die Expression des Zielproteins eliminiert oder reduziert und das resultierende Antikörpersignal mit einer geeigneten Kontrolle verglichen wird. Knockout-(KO)- und Knockdown-(KD)-Validierung können daher starke Hinweise darauf liefern, dass die Antikörperdetektion von der Anwesenheit des Zielproteins abhängt.

Die Antikörpervalidierung sollte stets im Kontext der getesteten Anwendung, des Probentyps und der experimentellen Bedingungen interpretiert werden. Eine Validierung in einem experimentellen System belegt nicht automatisch die Leistungsfähigkeit in jeder anderen Anwendung. Erfahren Sie im Folgenden mehr über verschiedene Validierungsansätze, unsere In-house-Validierung und entdecken Sie unser Portfolio an KO- und KD-validierten Antikörpern.

KO- und KD-validierte Antikörper entdecken

Genetische Antikörpervalidierung

Bei der genetischen Validierung wird die Antikörperspezifität untersucht, indem die Expression des Gens, das für das Zielprotein kodiert, experimentell verändert wird. Proben, in denen die Expression des Zielproteins eliminiert oder reduziert wurde, werden mit Proben verglichen, die das Zielprotein normal exprimieren. Verändert sich das Antikörpersignal entsprechend, unterstützt dies die Schlussfolgerung, dass das detektierte Signal vom beabsichtigten Zielprotein stammt.

Zwei häufig eingesetzte Strategien sind der Knockout (KO), bei dem das Zielgen inaktiviert wird, und der Knockdown (KD), bei dem die Expression des Zielgens reduziert wird. Obwohl beide Ansätze auf demselben Grundprinzip beruhen, unterscheiden sich das erwartete experimentelle Ergebnis und dessen Interpretation.

Knockout-(KO)-Validierung

Bei der Knockout-Validierung wird die Antikörperdetektion in einer Zielprotein-exprimierenden Probe mit einer genetisch vergleichbaren Probe verglichen, in der das Zielgen inaktiviert wurde. CRISPR/Cas-Genomeditierung wird häufig zur Erzeugung von Knockout-Zelllinien eingesetzt, jedoch können auch Knockout-Tiermodelle und andere genetisch defiziente Modelle als geeignete Kontrollen dienen.

In einem idealen KO-Validierungsexperiment erzeugt die Wildtyp- oder Ausgangsprobe ein zielproteinspezifisches Antikörpersignal, während dieses Signal in der Knockout-Probe fehlt. Dieser Vergleich stellt eine genetisch definierte Negativkontrolle dar und kann starke Evidenz dafür liefern, dass das beobachtete Antikörpersignal von der Expression des Zielproteins abhängt.

Bei einer Western-Blot-Validierung sollte beispielsweise in der Wildtyp-Probe eine Bande mit dem erwarteten Molekulargewicht detektierbar sein, die im entsprechenden Knockout-Lysat verschwindet. Dasselbe Prinzip kann auch auf andere antikörperbasierte Methoden angewendet werden, sofern geeignete KO-Kontrollen verfügbar sind.

Auch KO-Validierungsdaten müssen jedoch angemessen interpretiert werden. Genomeditierung kann zur Bildung alternativer oder verkürzter Proteinprodukte führen, und Knockout-Zellen können kompensatorische biologische Veränderungen durchlaufen. Das experimentelle System sollte daher bestätigen, dass das relevante Zielprotein beziehungsweise das vom Antikörper erkannte Epitop tatsächlich fehlt.

KO-validierte Antikörper anzeigen

Beispiel für einen KO-validierten Antikörper: Synaptopodin

Der Synaptopodin-Antikörper ABIN1742348 ist ein Beispiel für einen KO-validierten Antikörper in unserem Portfolio. Synaptopodin ist ein Aktin-assoziiertes Protein, das in differenzierten Podozyten und bestimmten neuronalen Kompartimenten exprimiert wird. Knockout-Kontrollen ermöglichen hier eine besonders stringente Beurteilung der zielabhängigen Signaldetektion.

Im Validierungsexperiment wird das mit dem Synaptopodin-Antikörper erhaltene Signal zwischen Wildtyp- und Synaptopodin-Knockout-Mausgehirnhomogenaten verglichen. Der Verlust des spezifischen Signals in der Knockout-Probe unterstützt eine zielproteinspezifische Detektion.

Weitere Informationen

Nachweis von Synaptopodin in Wildtyp-(WT)- und Synaptopodin-Knockout-(KO)-Mausgehirnhomogenaten.

Knockdown-(KD)-Validierung

Die Knockdown-Validierung folgt einem ähnlichen Prinzip, reduziert jedoch die Expression des Zielproteins, anstatt sie vollständig zu eliminieren. Gen-Silencing kann beispielsweise mithilfe von siRNA oder shRNA erreicht werden; auch andere Systeme wie CRISPR-Interferenz können zur Unterdrückung der Genexpression eingesetzt werden.

Das Antikörpersignal wird zwischen Kontrollzellen und Zellen verglichen, in denen die Expression des Zielproteins reduziert wurde. Eine entsprechende Abnahme des Antikörpersignals unterstützt die Schlussfolgerung, dass das detektierte Signal mit dem beabsichtigten Protein zusammenhängt.

Im Gegensatz zur Knockout-Validierung ist in der Regel ein verbleibendes Antikörpersignal zu erwarten, da ein Knockdown selten die gesamte Zielproteinexpression eliminiert. Das Ausmaß der Signalreduktion sollte daher gemeinsam mit der Effizienz der Zielproteindepletion bewertet werden.

Die KD-Validierung kann besonders nützlich sein, wenn ein vollständiger Knockout biologisch schwierig ist oder der Verlust des Zielproteins die Zellviabilität beziehungsweise den Phänotyp erheblich beeinflusst. Eine unvollständige Genstilllegung sowie Off-Target-Effekte des Knockdown-Verfahrens können die Interpretation jedoch komplexer machen als bei einem gut charakterisierten Knockout-Modell.

KD-validierte Antikörper anzeigen

Beispiel für einen KD-validierten Antikörper: SNAP47

Der SNAP47-Antikörper ABIN1742240 ist ein Beispiel für einen KD-validierten Antikörper in unserem Portfolio. SNAP47 ist ein Synaptosomen-assoziiertes Protein, das am Vesikeltransport beteiligt ist. Die Knockdown-Validierung hilft zu zeigen, dass die Antikörperdetektion der reduzierten Expression des Zielproteins folgt.

In den Validierungsdaten werden Kontrollproben mit SNAP47-siRNA-behandelten Proben verglichen. Eine verringerte Immunfluoreszenz und ein reduziertes Western-Blot-Signal nach dem Knockdown unterstützen zusammen mit der quantitativen Analyse die zielproteinspezifische Detektion von SNAP47. Immunfluoreszenz- und Western-Blot-Analysen zeigen nach siRNA-vermitteltem Knockdown ein reduziertes SNAP47-Signal. Die Quantifizierung bestätigt signifikant verringerte SNAP47-Spiegel (P < 0,005). βIII-Tubulin dient als Ladekontrolle.

Weitere Informationen

Knockdown-Validierung von SNAP47 in Kontrollproben und mit SNAP47-siRNA behandelten Proben.

Knockout- vs. Knockdown-Validierung

KO- und KD-Validierung verwenden dieselbe grundlegende Strategie: Die Expression des Zielproteins wird verändert und anschließend untersucht, ob das Antikörpersignal dieser Veränderung folgt. Der wesentliche Unterschied besteht darin, ob die Zielproteinexpression vollständig eliminiert oder lediglich reduziert wird.

Interpretation von Validierungsdaten

KO- und KD-Experimente liefern starke Evidenz für die Antikörperspezifität, wenn Veränderungen des Antikörpersignals mit genetisch kontrollierten Veränderungen der Zielproteinexpression übereinstimmen. Die Antikörpervalidierung ist jedoch keine absolute Eigenschaft eines Reagenzes. Die Leistungsfähigkeit kann von der Anwendung, der Probenvorbereitung, der Spezies, dem Gewebe- oder Zelltyp, der Antikörperkonzentration und den experimentellen Bedingungen abhängen.

Die genetische Validierung sollte daher als Evidenz betrachtet werden, die die Antikörperleistung im getesteten experimentellen Kontext unterstützt. Wenn möglich, kann die Aussagekraft durch die Kombination genetischer Validierung mit zusätzlichen Ansätzen erhöht werden, beispielsweise durch unabhängige Antikörper, orthogonale Expressionsdaten oder andere geeignete Positiv- und Negativkontrollen.