Antibody and immunoglobulin alternatives (Part 2)

Nicht-Ig-basierte Alternativen

Das gemeinsame Merkmal von Antikörpermimetika ist das Ziel, Alternativen bereitzustellen, die eine vergleichbare oder bessere Leistung als Antikörper bieten. Ihre Ursprünge sind sehr unterschiedlich, und entsprechend steht eine große Bandbreite strukturell sehr heterogener Plattformen zur Verfügung. Im Allgemeinen bestehen diese Alternativen aus kurzen Polypeptid- oder Oligonukleotidketten, die eine einfache, thermodynamisch stabile Faltung einnehmen. Sie müssen Aminosäure- oder Nukleotidsubstitutionen innerhalb ihrer Zielbindungsregionen tolerieren, damit sie für das Screening kombinatorischer Bibliotheken geeignet sind.

Viele dieser Antikörpermimetika enthalten keine Disulfidbrücken und können daher unter den reduzierenden Bedingungen des Zytoplasmas produziert werden. Dies und das Fehlen posttranslationaler Modifikationen erweitert das Spektrum verfügbarer Expressionssysteme, einschließlich kostengünstiger bakterieller Systeme. Darüber hinaus zählen eine erhöhte Reproduzierbarkeit und die Möglichkeit, Binder gegen schwer zugängliche Targets zu entwickeln, zu den wesentlichen Vorteilen nicht-Ig-basierter Antikörperalternativen.

Neben der Produktion ist auch die Lagerung dieser Produkte häufig einfacher als die von Antikörpern, da sie unter Bedingungen stabil bleiben, die konventionelle Antikörper denaturieren oder schädigen würden. Zu diesem Zweck basieren Antikörperalternativen auf einem biologisch inerten Gerüst, das die Ausbildung von Strukturen begünstigt und dadurch eine große Interaktionsfläche für eine starke Bindung bereitstellt. Modifizierbare Bereiche stellen dabei die spezifischen Kontakte zum jeweiligen Target her und erreichen häufig Affinitäten im nM- bis pM-Bereich. Die Wiederholungseinheiten sollten sich selbst organisieren, idealerweise ohne Disulfidbrücken zu benötigen. Strukturell relevante Aminosäurereste sollten sich von denjenigen unterscheiden, die die Spezifität bestimmen, damit die Spezifität des Proteins gezielt verändert werden kann, ohne seine strukturelle Integrität zu beeinträchtigen.

Darüber hinaus beruht ihre gute Eignung für Engineering auch darauf, dass diese Gerüste für spezifische Binder eine Möglichkeit bieten, bestehende Schutzrechte zu umgehen. Antikörperbasierte Arzneimittel sind umfassend durch Patente geschützt, wodurch es für Pharmaunternehmen schwierig sein kann, ihre Anwendung auszuweiten. Aufgrund ihrer geringen Größe müssen manche Antikörpermimetika an einen Träger wie IgG fusioniert werden, um die renale Clearance zu verlangsamen und die gewünschten pharmakokinetischen Eigenschaften zu erreichen.

Nicht-Ig-basierte Alternativen werden bislang noch nicht im gleichen Umfang eingesetzt wie konventionelle Immunglobuline. Dies könnte sich jedoch in naher Zukunft sowohl für klinische als auch für Forschungsanwendungen ändern. Es existiert eine Vielzahl natürlich vorkommender Proteindomänen, die für das Engineering spezifischer Binder genutzt werden können, darunter:

• Aptamere
• DARPins
• Affimere
• Avimere
• Knottine
• Monobodies
• Affinity Clamps

Aptamere

Aptamere sind auf Nukleinsäuren oder Peptiden basierende Binder, die Proteine, Nukleinsäuren und andere Moleküle spezifisch erkennen. Auch ganze Zellen und sogar Gewebe können zu ihren Targets gehören. Nukleinsäure-Aptamere werden mithilfe von SELEX oder In-vitro-Selektion entwickelt. X-Aptamere enthalten chemisch modifizierte Nukleotide und DNA-Rückgrate, um ein breiteres Spektrum möglicher Targets oder eine höhere Affinität und Spezifität zu erreichen. Aus demselben Grund können jedoch nicht dieselben Amplifikations- und Selektionsmechanismen wie bei RNA- und DNA-Aptameren angewendet werden. Peptidbasierte Aptamere bestehen dagegen aus einer variablen Schleifenregion, die an beiden Enden an ein großes Gerüstprotein gebunden ist, um die Löslichkeit zu gewährleisten.

Traditionell wird eine randomisierte Peptid-Expressionsbibliothek über das Thioredoxin-A-Protein (TrxA) von E. coli präsentiert. Auch andere Gerüste wie GFP wurden verwendet. Aptamere mit der gewünschten Spezifität werden mithilfe des Yeast-Two-Hybrid-Systems oder etablierter Display-Techniken selektiert.

Slow Off-rate Modified Aptamers (SOMAmers¹) sind eine besondere Klasse von Aptameren, die aus einer kurzen DNA-Sequenz bestehen und mehrere modifizierte Basen mit proteinähnlichen Seitenketten enthalten. Sie nutzen somit das Potenzial synthetischer Nukleotidmodifikationen, um einem Nukleinsäuregerüst proteinähnliche Eigenschaften und eine größere Diversität zu verleihen.

DARPins²

Designed Ankyrin Repeat Proteins basieren auf der Struktur natürlich vorkommender Ankyrine, einer Proteinklasse, die die Verankerung integraler Membranproteine am Membranzytoskelett vermittelt. Sie bestehen typischerweise aus vier bis sechs Wiederholungseinheiten mit jeweils 33 Aminosäuren, die aus einer β-Schleife gefolgt von zwei antiparallelen α-Helices bestehen.

Während strukturell wichtige, konservierte Aminosäurereste als Gerüst erhalten bleiben, lassen sich bei DARPins die Aminosäurereste, die mit dem Bindungspartner interagieren, sehr gut mithilfe von Ribosomen- oder Phagen-Display-Verfahren modifizieren.

Die Module werden durch hydrophobe Wechselwirkungen zusammengehalten, mit Ausnahme der hydrophilen N- und C-Termini beziehungsweise Caps, die dem Lösungsmittel ausgesetzt sind. Aufgrund der starken Kopplung zwischen den Wiederholungseinheiten sind DARPins mit mindestens vier internen Repeats äußerst resistent gegenüber Denaturierung und lassen sich sowohl in E. coli als auch in zellfreien Expressionssystemen gut exprimieren.

Affimere

Das rationale Design eines neuartigen Gerüsts zur Präsentation strukturell eingeschränkter Peptide auf Grundlage der gewünschten Eigenschaften von Antikörpermimetika führte zur Entwicklung von Affimeren auf Basis von humanem Stefin A (SteA). Ihr Stefin-A-Dreifachmutant (STM) besteht aus 98 Aminosäuren in einer einzelnen Kette und weist keine posttranslationalen Modifikationen auf³. Darüber hinaus wird die Stabilität der Faltung durch die Insertion eines Peptids, das dem Protein seine Target-Spezifität verleiht, nicht beeinträchtigt. Diese auf STM basierenden Affimere werden als Typ-I-Affimere bezeichnet.

Typ-II-Affimere basieren auf dem Cysteinprotease-Inhibitor Cystatin⁴. Dabei dient Cystatin als Gerüst zur Präsentation von zwei Schleifen und eines variablen N-terminalen Abschnitts, die dem Protein seine Spezifität verleihen. Die beiden Schleifen können jeweils 12 bis 36 Aminosäuren umfassen und dadurch eine große Interaktionsfläche mit dem anvisierten Antigen bilden. Der Umfang dieser Interaktionsfläche ist für die hohe Spezifität und Bindungsaffinität verantwortlich.

Avimere⁵

Aviditätsmultimere werden von humanen A-Domänen abgeleitet, die in verschiedenen Zelloberflächenrezeptoren vorkommen. Sie bestehen aus zwei oder mehr Peptidsequenzen mit jeweils 30–35 Aminosäuren, von denen jede ein anderes Epitop erkennt. Dadurch entstehen Proteine, die an mehrere Stellen eines oder mehrerer Targets mit Affinitäten bis in den pikomolaren Bereich binden können. Die unterschiedlichen Domänen werden durch Exon-Shuffling und sequenzielle Selektionsschritte erzeugt.

Die Struktur jedes „Monomers“ wird durch vier kalziumbindende Aminosäurereste, zwei Gerüstreste und sechs Cysteine definiert, die drei Disulfidbrücken bilden. Bemerkenswerterweise können diese Disulfidbrücken nach Oxidation erfolgreich gebildet und die Untereinheiten nach der Produktion im Zytoplasma von E. coli korrekt gefaltet werden.

Knottine⁶

Knottine sind kleine, disulfidreiche Proteine mit mindestens drei Disulfidbrücken, die durch einen charakteristischen Disulfidknoten mit Kleeblattstruktur gekennzeichnet sind. Diese Kernstruktur macht sie äußerst resistent gegenüber Proteolyse und Temperaturschwankungen, während exponierte Schleifen die Spezifität gegenüber dem jeweiligen Target vermitteln. Aufgrund ihrer geringen Größe von nur wenigen kDa besitzen Knottine ein erhebliches Potenzial als Arzneimittel und neuartige molekulare Bildgebungsreagenzien.

Monobodies⁷

Trotz ihres Namens sind Monobodies keine Antikörperderivate. Stattdessen verwenden sie die Typ-III-Domäne des humanen Fibronectins (FN3) als Gerüst, auf das Schleifen zur spezifischen Target-Erkennung übertragen werden können. Das FN3-Gerüst umfasst 94 Aminosäuren und ähnelt der VH-Domäne eines Antikörpers. Es enthält jedoch keine Disulfidbrücken. Seine Bindungsspezifität kann mithilfe von Phagen- und Yeast-Display-Techniken gezielt verändert werden.

Affinity Clamps⁸

Diese rekombinanten Bindungsproteine kombinieren zwei Proteindomänen, die über eine Gelenkregion miteinander verbunden sind und sich wie eine „Klammer“ um kurze Peptidmotive legen. Beide Domänen wirken synergistisch und erreichen dadurch ein Maß an Spezifität und Affinität, das von keiner der beiden Domänen allein erzielt werden könnte. Ihre Spezifität ist tatsächlich hoch genug, um ein einzelnes Peptid-Target innerhalb des zellulären Hintergrunds zu erfassen. Spezifität und Affinität der Interaktionsdomäne und der Verstärkungsdomäne können durch iterative Mutations- und Selektionszyklen verändert werden.

Fazit

Diese Liste kann lediglich einen Einblick in die Vielfalt der Plattformen geben, die heute als Antikörpermimetika zur Verfügung stehen. Sie erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit und lässt sogar einige bereits etablierte Gerüste wie Affiline⁹, von Protein A abgeleitete Affibodies¹⁰ und mit Lipocalinen verwandte Anticaline¹¹ unberücksichtigt.

Derzeit haben nur wenige dieser Plattformen spezifische Binder hervorgebracht, die für Forschungsanwendungen unmittelbar verfügbar sind. Die Forschungs- und Entwicklungsaktivitäten zu diesen verschiedenen Antikörperalternativen konzentrieren sich jedoch im Wesentlichen auf die vergangenen 25 Jahre. Es lässt sich nur erahnen, welche Möglichkeiten diese Moleküle in den kommenden 100 Jahren sowohl als Therapeutika als auch als Forschungsreagenzien eröffnen werden.

Weitere Informationen

Alternativen zu konventionellen Immunglobulinen (Teil 1)

Literatur