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ELISA methods, Direct Assay, Indirect Assay, Sandwich Assay, Competitive Assay

Eine Einführung in ELISA (Teil 2)

ELISA ist eine außerordentlich leistungsfähige und vielseitige Technik, für die es eine Reihe von Möglichkeiten gibt. Dieser Artikel befasst sich mit den verschiedenen ELISA-Formaten, die am häufigsten im Handel erhältlich sind, und erörtert die feinen Unterschiede zwischen ihnen.

Wenn Sie einen grundlegenden allgemeinen Überblick über ELISA suchen und wissen möchten, ob ein ELISA das richtige Testdesign für Ihr Experiment ist, lesen Sie bitte An Introduction to ELISA (Part 1).

Direkt-ELISA

Der direkte ELISA ist das einfachste ELISA-Format. Bei einem direkten ELISA:

  • Der Analyt wird auf einem festen Träger (meist eine 96-Well-Mikrotiterplatte) immobilisiert.
  • Ein enzymkonjugierter Antikörper, der gegen das Antigen gerichtet ist, wird über die Platte gewaschen.
  • Der Antikörper erkennt und bindet den immobilisierten Analyten, nicht gebundener Antikörper wird weggespült.
  • Ein farbloses chromogenes Substrat wie TMB (3,3',5,5'-Tetramethlybenziden) wird in die Lösung gegeben.
  • Das Enzymkonjugat reagiert mit dem chromogenen Substrat und wandelt es in ein dunkel gefärbtes Derivat um.
  • Der Grad der Farbveränderung wird mit einem spektrophotometrischen Plattenlesegerät gemessen.

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Es ist wichtig, daran zu denken, dass das Enzym, das die Farbwechselreaktion katalysiert, mit einem Antikörper konjugiert ist, der wiederum an ein Antigen gebunden ist, das auf der Platte immobilisiert wurde. Daher hängt die Reaktionsgeschwindigkeit von der Menge des vorhandenen Enzyms ab, die wiederum von der Menge des an die Platte gebundenen Analyten und der Affinität des Antikörpers zu diesem Analyten abhängt.

Hinweis: Unkontrolliert würde jede Menge Enzym schließlich fast das gesamte TMB in der Lösung katalysieren, so dass eine Unterscheidung zwischen Proben mit einer hohen Analytkonzentration und solchen mit einer niedrigen Analytkonzentration nicht mehr möglich ist. Um dies zu verhindern, wird die Reaktion zu einem bestimmten Zeitpunkt durch Zugabe von Schwefelsäure gestoppt.

Direkt-ELISAs sind nur selten im Handel erhältlich, vor allem weil das Hauptanliegen der meisten Endnutzer darin besteht, das Vorhandensein ihres Analyten in einer komplexen biologischen Probe zu bestätigen und seine Konzentration zu messen. Aufgrund der Beschaffenheit der Matrix in diesen Proben ist es dem Forscher oft nicht möglich, die Probe auf einer Platte oder einem anderen festen Träger zu fixieren. Ein Forscher könnte sich für einen ELISA im Direktformat entscheiden, wenn er die Wirksamkeit eines neuen Antikörpers gegen ein bekanntes Ziel testen will, das er auf einer Mikrotiterplatte immobilisieren kann, oder wenn er die Konzentration eines gereinigten rekombinanten Proteins mit einer Reihe von bekannten Konzentrationsstandards vergleichen will.

Fig. 1: Ein repräsentatives Bild des direkten ELISA. Der Analyt ist direkt auf die Platte aufgetragen und wird von einem enzymkonjugierten Antikörper erkannt.

Indirekter ELISA

Der indirekte ELISA ist eine Variante des direkten ELISA. Das Verfahren ist identisch, mit Ausnahme des Nachweisschritts. Bei einem indirekten ELISA ist der primäre Antikörper, der zum Nachweis des Analyten verwendet wird, nicht mit einem Enzym konjugiert. Stattdessen wird der Mischung ein enzymkonjugierter sekundärer Antikörper zugesetzt, der gegen den primären Antikörper reaktiv ist.

Hinweis: Der indirekte ELISA wird auch zum Nachweis und zur Quantifizierung der Seropositivität für ein bestimmtes Antigen verwendet. ABIN1540248 verwendet beispielsweise die indirekte ELISA-Methode zum Nachweis von Antikörpern gegen das Medikament Infliximab in Humanserum. Eine bekannte Menge Infliximab wird auf die Platte aufgetragen und in die beschichteten Vertiefungen gegeben. Ein markierter Sekundärantikörper wird dann zum Nachweis der menschlichen Antikörper gegen Infliximab verwendet, die von dem immobilisierten Antigen eingefangen wurden.

Die Verwendung eines sekundären Antikörpers hat bei einem ELISA viele der gleichen Vorteile wie bei anderen Proteomics-Methoden. Abgesehen davon, dass der Forscher sich nicht dem manchmal mühsamen Prozess der Konjugation eines primären Antikörpers unterziehen muss, kann ein sekundärer Antikörper dazu beitragen, ein schwaches Signal zu verstärken, wodurch ein zuvor nicht nachweisbares Signal sichtbar gemacht und die Nachweisgrenze des betreffenden Assays gesenkt werden kann.

Fig. 2: Ein repräsentatives Bild des indirekten ELISA. Der Analyt wird direkt auf die Platte aufgetragen, wobei der primäre Antikörper, der das Antigen erkennt, nicht markiert ist. Stattdessen wird ein markierter sekundärer Antikörper verwendet, der gegen den primären Antikörper reaktiv ist.

Sandwich (capture) ELISA

Die meisten im Handel erhältlichen ELISAs sind Sandwich-Tests. Der Test im Sandwich-Format heißt so, weil der Analyt zwischen zwei verschiedenen Antikörpern "eingeklemmt" ist. Bei einem Assay im Sandwich-Format:

  • Der Analyte ist NICHT direkt auf der Platte immobilisiert.
  • Ein "Capture"-Antikörper ist auf der Oberfläche der Vertiefungen der Platte immobilisiert.
  • Der "Capture"-Antikörper bindet den Analyten aus der Probe und hält ihn zurück. Die restliche Matrix wird weggespült.
  • Ein enzymkonjugierter "Detektor"-Antikörper, der gegen ein anderes Epitop des Analyten gezüchtet wurde, wird der Platte hinzugefügt.
  • Die kolorimetrische Standarddetektionsmethode (siehe oben) wird zum Nachweis und zur Quantifizierung des Analyten in der Probe verwendet.

Note: antibodies-online.com bietet Hunderte von zugelassenen Antikörpern für und in einem Sandwich-Format-Assay. Wenn die Möglichkeit besteht, sollten Sie jedoch den Kauf eines zugelassenen Antikörperpaares in Betracht ziehen, um die Kompatibilität bei der Entwicklung eines Assays im Sandwich-Format de novo sicherzustellen.

Ein monoklonaler Antikörper wird häufig als Capture-Antikörper in einem ELISA im Sandwich-Format gewählt. Monoklonale Antikörper binden von Natur aus nur ein einziges Epitop auf einem Antigen. Dies erhöht in der Regel die Spezifität eines Tests und reduziert das Hintergrundrauschen, was sie zu einer attraktiven Wahl für die Testentwicklung macht.

Der Einsatz von monoklonalen Antikörpern sowohl für den Fang als auch für den Nachweis in einem Sandwich-Assay ist im Allgemeinen nicht ratsam. Wenn das Epitop, das sowohl vom Fänger- als auch vom Detektionsantikörper erkannt wird, nicht genau kartiert wurde, ist es schwierig oder unmöglich vorherzusagen, ob der Fänger-Antikörper die Bindung des Detektionsantikörpers aufgrund sterischer Hindernisse blockieren wird. Die Bindungskonstante eines einzelnen monoklonalen Antikörpers ist außerdem in der Regel niedriger als die der besten Binder in einer heterogenen Mischung von polyklonalen Antikörpern, so dass ein Test, der ausschließlich mit monoklonalen Antikörpern entwickelt wurde, wahrscheinlich nie so empfindlich sein wird wie ein Test, der mindestens einen polyklonalen Antikörper verwendet.

Wie bei anderen Formaten kann der Nachweis in einem Assay im Sandwich-Format entweder direkt oder indirekt erfolgen (d. h. der Nachweisantikörper kann direkt markiert sein, oder es kann ein konjugierter sekundärer Antikörper verwendet werden, der gegen den Nachweisantikörper reagiert). Wird eine indirekte Nachweismethode gewählt, muss besonders darauf geachtet werden, dass der verwendete Sekundärantikörper nur mit dem De-Detektions-Antikörper und nicht mit dem auf die Platte aufgetragenen Fänger-Antikörper reagiert.

Fig. 3: Ein repräsentatives Bild des ELISA im Sandwich-Format. Das Sandwich-Format wird so genannt, weil der Analyt zwischen einem Fänger- und einem Nachweisantikörper "eingeklemmt" ist.

Kompetitiver ELISA

Der kompetitive ELISA ist vielleicht das am schwierigsten zu verstehende Assay-Design. Bei einem Assay im kompetitiven Format nimmt die Signalintensität mit steigender Antigenkonzentration in einer Probe ab. Bei einem kompetitiven ELISA:

  • Ein Antigenstandard wird auf der Oberfläche einer Platte immobilisiert.
  • Antikörper gegen den Analyten wird mit der Probe inkubiert.
  • Der Analyt in der Probe bindet und besetzt den Antikörper in der Lösung.
  • Das Antikörper/Probengemisch wird über die antigenbeschichteten Vertiefungen gewaschen.
  • Nicht besetzte Antikörper (solche, die den Analyten in der Probe nicht gebunden haben) binden den Antigenstandard auf der Platte.
  • Besetzte Antikörper (diejenigen, die den Analyt in der Probe gebunden haben) werden weggespült.
  • Ein kolorimetrisches Standardnachweisverfahren wird zum Nachweis und zur Quantifizierung des Analyten in der Probe verwendet.

Das zentrale Konzept eines kompetitiven ELISA besteht darin, dass eine größere Menge des Analyten in einer Probe zu weniger freien Antikörpern in der Lösung und damit zu einer geringeren Anzahl von markierten Antikörpern, die an den Standard auf der Platte gebunden sind, und zu einem weniger intensiven Signal führt.

Der Hauptvorteil eines kompetitiven ELISA im Vergleich zu einem Test im Sandwich-Format besteht darin, dass nur ein Antikörper den Analyten zum Nachweis binden muss. Dies macht den kompetitiven Assay zu einer attraktiven Option, wenn kein geeignetes Antikörperpaar für den Sandwich-ELISA identifiziert werden kann oder wenn der fragliche Analyt zu klein ist, um die Bindung sowohl eines Fänger- als auch eines Nachweisantikörpers zu ermöglichen.

Fig. 4: Ein repräsentatives Bild des kompetitiven ELISA-Formats. Bei einem kompetitiven ELISA führt eine höhere Konzentration des Analyten in der Probe zu einem reduzierten Signal.

Kompetitiver Hemmungs-ELISA

Die meisten kommerziell erhältlichen kompetitiven ELISA Kits (einschließlich der bei antibodies-online verkauften) folgen dem Format der kompetitiven Hemmung. Kompetitive Inhibitions-ELISAs unterscheiden sich geringfügig von einem klassischen kompetitiven ELISA. Bei einem kompetitiven Inhibitionstest wird ein Fängerantikörper auf eine 96-Well-Platte aufgetragen (ähnlich wie bei einem ELISA im Sandwich-Format). Unmarkiertes Antigen in der Probe und eine bekannte Konzentration eines markierten Antigenstandards (konjugiert mit HRP oder einem ähnlichen Nachweisverfahren) konkurrieren dann um die Bindungsaffinität des immobilisierten Antikörpers.

Bei einem kompetitiven Inhibitions-ELISA ist, wie bei einem klassischen kompetitiven ELISA, das aus der Farbänderung abgeleitete Signal umgekehrt proportional zur Antigenmenge in der Probe. Eine große Menge an Antigen in der Probe führt dazu, dass weniger markierter Standard an den Antikörper auf der Platte gebunden wird und das Signal geringer ausfällt. Umgekehrt führt eine geringe Antigenmenge in der Probe dazu, dass eine größere Menge des markierten Standards an die Platte gebunden wird und ein höheres kolorimetrisches Signal erzeugt.

Schlussfolgerung

ELISA ist ein schnelles, einfaches und leistungsfähiges Verfahren, das eine Reihe von Vorteilen gegenüber anderen gängigen Proteomics-Techniken bietet. Wir hoffen, dass dieses Dokument Ihnen einen Einblick in die verschiedenen kommerziell erhältlichen ELISA-Methoden gegeben hat und Ihnen bei der Entscheidung geholfen hat, ob ELISA die richtige Methode für Ihr geplantes Experiment ist. Wenn Sie noch Fragen zu dieser oder einer anderen Methode haben, können Sie sich gerne an unseren Kundenservice wenden. Er hilft Ihnen gerne, das richtige Produkt für Ihre Bedürfnisse zu finden.

antibodies-online.com bietet die weltweit größte Auswahl an ELISA Kits und Forschungsreagenzien und vertreibt Hunderttausende von hochwertigen, bewährten Kits von Anbietern wie Raybiotech, Assay Biotechnology und Arbor Assays. Darüber hinaus bieten wir eine Vielzahl von Produkten an, die für ELISA-ähnliche und ELISA-abgeleitete Methoden zugelassen sind, die über den Rahmen dieses Artikels hinausgehen. Der Antikörper-Online-Katalog enthält eine Fülle von Produkten für Anwendungen wie ELISpot und CLIA (eine hochempfindliche ELISA-ähnliche Technik, die Chemilumineszenz als Nachweismethode verwendet). Kontaktieren Sie uns, um mehr über diese Methoden zu erfahren.

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