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Immunblotting und Western Blotting

Western Blot: Hintergrundinformationen

Der Western Blot stellt ein Verfahren zum Nachweis von Proteinen in einem Proteingemisch (z.B. Zelllysat) dar. Im ersten Schritt wird das Proteingemisch mittels einer Gel-Elektrophorese in einer Trägermatrix (SDS-PAGE, Native-PAGE, isoelektrische Fokussierung, 2D-Gelelektrophorese, usw.) entsprechend der Protein-Größe, -Ladung oder anderer Eigenschaften aufgetrennt in einzelne Proteinbanden. Die getrennten Proteinbanden werden danach für den Western Blot aus dem Gel auf eine feste Trägermembran (z.B. aus Nitrozellulose, Nylon oder PVDF) transferiert. Dieser Vorgang wird Blotting genannt. Aufgrund Ladungswechselwirkungen bleiben die Proteine an der Membranoberfläche im Muster der elektrophoretischen Auftrennung haften und sind für die Antikörper-Bindung zur Detektion zugänglich.


Man benutzt dazu Antikörperkonjugate, die markiert sind, z.B. mit Fluoreszenzfarbstoffen oder Enzymen für eine nachfolgende Farbreaktion, oder radioaktiv zur anschließenden Autoradiographie.
Western Blotting (immunoblot)

Der Name entstand als Namensspiel, in Anlehnung an den sogenannten Southern Blot, einem ähnlichen Verfahren zum Nachweis spezifischer DNA-Sequenzen. Der Southern Blot wurde durch Ed Southern erstmals beschrieben und nach ihm benannt. Ein weiteres Wortspiel ist der Northern Blot und Southwestern Blot.

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Gelelektrophorese

Zur Auftrennung der Proteine kann man zwischen verschiedenen Elektrophorese-Arten wählen, je nachdem nach welchen Kriterien die Proteine getrennt werden sollen. Als Methoden bieten sich insbesondere SDS-PAGE, Nativ-PAGE und die isoelektrische Fokussierung an.

SDS-PAGE:
Es handelt sich hierbei um ein denaturierendes Verfahren. Die Denaturierung kommt durch die Behandlung der Proteine mit dem anionischen Detergens SDS (Natriumdodecylsulfat) zustande. Bei der Behandlung mit SDS gehen die Sekundär- und Tertiärstrukturen der Proteine verloren. Darüber hinaus lagert sich das SDS an die Proteine an und verdeckt deren Eigenladung. Das Protein ist danach gleichmäßig negativ geladen. Die anschließende Trennung erfolgt anhand der relativen Größe der Polypeptidketten im Polyacrylamidgel.

Native-PAGE:
Dies ist eine Variante der Gelelektrophorese, bei der native, gefaltete, nicht-denaturierte Proteine aufgetrennt werden. Mit dieser Methode ist es möglich, Proteine aufzuspalten, die mit anderen Methoden nicht zu trennen sind. Dazu gehören zum Beispiel modifizierte und nicht-modifizierte Proteine derselben Art (z.B. Trennung eines Proteins in seiner phosphorylierten und nicht-phosphorylierten Form). Ebenso dient es dazu, Proteine zu trennen, die biologisch relevante Konformationen aufweisen und z.B. in di-, tri- oder tetramerer Form vorkommen (im Gegensatz zur SDS-PAGE, bei der die denaturierten Polypeptidketten einzeln aufgetrennt werden). Es ist ebenfalls möglich, Komplexe aus verschiedenen Proteinen nachzuweisen.
Die Trennung mit dem Nativ-PAGE ist von verschiedenen Parametern abhängig. Dazu gehört die Ladung des Proteins, seine Größe und seine räumliche Struktur. Um die Faltung der Proteine während des Verfahrens beizubehalten, muss ein geeigneter Puffer verwendet werden. Die Eignung des Puffers hängt vom isoelektrischen Punkt bzw. den Ladungseigenschaften des Proteins ab.

Isoelektrische Fokussierung:
Bei dieser Methode macht man sich zu Nutze, dass jedes Protein eine bestimmte Ladung bei einem bestimmten pH-Wert besitzt. Je nach pH-Wert tragen die sauren und basischen funktionellen Gruppen eines Proteins mehr oder weniger stark zu seiner Gesamtladung bei. Der pH-Wert, bei dem genau so viele positive wie negative Ladungen innerhalb des Proteins vorliegen und beim dem die Gesamtladung null ist, bezeichnet man als isoelektrischen Punkt.
Für die isoelektrische Fokussierung benötigt man spezielle Gele, die einen pH-Gradienten aufweisen, d.h. der pH-Wert innerhalb des Gels ändert sich z.B. von sauer zu basisch. Legt man an ein solches Gel eine elektrische Spannung an, so wandert ein Protein bis zu der Stelle im Gel, an der der pH-Wert dem isoelektrischen Punkt des Proteins entspricht und seine Gesamtladung null ist. Das Verfahren dient zur ladungsabhängigen Trennung von Proteingemischen sowie zur Ermittlung des isoelektrischen Punktes eines Proteins. Die Trennung erfolgt nach Ladung des Proteins, bzw. anhand der Anzahl saurer oder basischer funktioneller Gruppen, die das Protein enthält.

Neben den oben genannten Methoden können auch andere, z.B. kombinierte, Methoden zur Proteintrennung eingesetzt werden. Die Methode der Wahl hängt von den speziellen Anforderungen des Experiments ab.

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Blotting

Nach der Trennung des Proteingemischs erfolgt das Aufbringen der Polypeptidbanden auf einen festen Träger, die Membran. Dazu wird das Gel mit den Polypeptidbanden in eine spezielle Elektrophoresekammer gegeben, in der sich auch die Membran befindet. An dieser Stelle ist es möglich, eventuell vorhandenes SDS auszuwaschen, so dass die Proteine teilweise renaturieren und ihre Sekundär- und Tertiärstruktur partiell wiedererlangen. Durch das Anlegen einer elektrischen Spannung senkrecht zur Laufrichtung des Gels wandern die Proteinbanden aus dem Gel heraus und gelangen auf die Membran, wo sie gebunden werden. Das Muster der getrennten Proteinbanden bleibt dabei erhalten. Die ?geblotteten? Banden sind nun weiteren Methoden zugänglich (z.B. für die Detektion bestimmter Proteine mit spezifischen Antikörpern).

Hint: Ladekontrollen sind essentiell, um sicherzustellen, daß die verschiedenen Proben in vergleichbaren Mengen geladen werden und der Transfer auf die Mebran funktioniert hat.

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Immunodetektion

Nach Trennung und Blotting der Proteinbanden ist es möglich, bestimmte Proteine mit spezifischen Antikörpern zu identifizieren. Der spezifische Antikörper (mono- oder polyklonal) bindet an seiner Proteinbande. Unspezifisch bindende Antikörper können mittels Waschen entfernt werden (mit Pufferlösungen, die Detergenzien enthalten). Außerdem ist es möglich, vor der Antikörperzugabe unspezifische Bindungsstellen zu blockieren.
In der Regel wird zuerst ein primärer Antikörper eingesetzt, der wiederum durch einen Sekundärantikörper nachgewiesen wird. Bei dem Sekundärantikörper handelt es sich um ein Konjugat, in dem der Antikörper mit einem Farbstoff, einem Enzym oder radioaktiv markiert ist. Es werden auch oft Biotin-konjugierte Antikörper verwendet.
Es kann von Vorteil sein, als Primärantikörper polyklonale Antikörper einzusetzen. Monoklonale Antikörper haben in der Regel eine niedrigere Bindungsaffinität als polyklonale Antikörper. Bei polyklonalen Antikörpern hat man dagegen mehrere Epitope zur Auswahl, die erkannt werden können. Nach der Immundetektion ist es möglich, den gebundenen Antikörper wieder zu entfernen (stripping) und die Membran für weitere Analysen mit anderen Antikörpern einzusetzen (etwa um andere Proteine aus einem Gemisch nachzuweisen).
Die Auswertung des Western Blots erfolgt über verschiedene Imaging Systeme (Lumineszenz, Farbreaktion, Autoradiographie, usw.).

Hint: Die Identifizierung eines Proteins im Western Blot basiert unter anderem auf dessen Molekulargewicht. Zu diesem Zweck werden die elektrophoretisch getrennten Proteine einer Probe mit einem Molekulargewichtsmarker verglichen, dessen Zusammensetzung definiert ist (s. hier und hier).

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Warum Western Blot?

Die Western Blot Methode besitzt einige Vorteile gegenüber anderen ISAs (immunosorbent assays), wie etwa dem ELISA. Die Methode ist um einen Aspekt erweitert: der Auftrennung des Proteingemisches nach Größe, Ladung und/oder Konformation. Während ein ELISA nur die Detektion und Quantifizierung eines bestimmten Proteins/Peptids erlaubt, kann man die geblotteten Proteinbanden auf unterschiedliche relevante Proteinen analysieren, indem man verschiedene Antikörper einsetzt und wieder entfernt (strippen). Zudem erhält man über die Trennung der Proteinbanden eine zusätzliche Information über die Größe des detektierten Proteins/Polypeptids. Darüber hinaus ist auch eine (Semi-)Quantifizierung möglich, wenn man einen internen Mengenstandard mit überprüft. Auch der Proteingehalt der verschiedenen Proben lässt sich untereinander vergleichen (Probe A enthält mehr Protein als Probe B).

Ein Nachteil des Western Blots ist, dass er zeitaufwendiger als ein ELISA ist und Erfahrung des Experimentators erfordert. Ebenso ist eine Optimierung der Versuchsbedingungen erforderlich (z.B. bei der Art der Proteinisolation, bei den Puffersystemen, dem Trennverfahren, der Gelkonzentration, usw.).

Die Anwendungsmöglichkeiten des Western Blots sind sehr vielfältig, so dass diese Methode für die verschiedensten Themengebiete angewandt wird.

Hinweis: Auf antikoerper-online.de finden Sie mehr als empfohlen sind.

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