Western Blotting: Arbeitsprotokoll

Im folgenden finden Sie ein Beispiel einer Arbeitsanweisung für Western Blotting. Dieses Protokoll dient der schematischen Darstellung der Arbeitsabläufe. Alle Angaben sind lediglich Beispiele und müssen an Ausstattung und individuelle Bedürfnisse angepasst werden. In der individuellen Anwendung eines Antikörpers muss zudem immer beachtet werden, dass das Protokoll an die speziellen Eigenschaften des Antikörpers angepasst werden muss. Insbesondere Konzentration, Inkubationszeit und Inkubationstemperatur müssen individuell ermittelt und optimiert werden.

1. Vorbereitung der Lösungen und Puffer

A. Puffer ansetzen

Resolving Buffer (Lagerung bei 4°C)
90,9 g Tris (1,5 M)
500 ml dest. H2O
pH 8,8 einstellen

Stacking Buffer (Lagerung bei 4°C)
30,2 g Tris (0,5 M)
500 ml dest. H2O
pH 6,8 einstellen

10x Running Buffer (Lagerung bei RT)
30 g Tris
144 g Glycin
10 g SDS
1 l dest. H2O
pH sollte 8,6 betragen; bei groben Abweichungen verwerfen

Transfer Buffer (Lagerung bei 4°C):
6 g Tris (25 mM)
28,8 g Glycin (190 mM)
400 ml Methanol (20%)
2000 ml dest. H2O

Tris-Tween Buffered Saline

10X TTBS:	1x TTBS entspricht:	Bedarf für 2 l:
87,66 g NaCl (1,5 M) 39,4 g Tris-HCl (250 mM) 20 ml Tween 20 (0,01%) Ad 1000 ml Aqua dest pH 7,4	50 mM Tris pH8.0 150 mM NaCl 0,1% Tween20	50 ml aus 1 M Tris, pH 8.0 Stock 60 ml aus 5 M NaCl Stock 8 ml aus 25% Tween20 Stock

Magermilch (für 100 ml):
3-5 g Magermilchpulver (non fat!)
100 ml TTBS

BSA (für 100 ml):
2,5-5 g BSA
100ml TTBS

2x Sample Buffer (reduzierend)
2,4 ml Aqua dest
2,4 ml Stacking buffer
2,0 ml Glycerol
2,0 ml SDS (10%)
200 µl Bromphenolblau
40 µl EDTA (0.5 M)
1,0 ml ß-Mercaptoethanol

ß-Mercaptoethanol erst vor Gebrauch zugefügen
Sample Buffer mit Mercaptoethanol hält sich etwa 2-3 Wochen

B Gelmixe

Trenngel

Anzahl der Gele	4	4	2	4	4
Konzentration	5%	7,5%	10,0%	10,0%	12,5%
Volumen (gesamt) H2O Resolving Buffer SDS 10% Acryl-/Bisacrylamid 30% TEMED APS 10%	ca. 25 ml 14,3 ml 6,3 ml 250 µl 4,2 ml 12,5 µl 125 µl	ca. 25 ml 9,6 ml 5 ml 200 µl 5 ml 20 µl 200 µl	ca. 10 ml 4 ml 2,5 ml 100 µl 3,4 ml 10 µl 100 µl	ca. 25 ml 8 ml 5 ml 200 µl 6,8 ml 20 µl 200 µl	ca. 25 ml 6,6 ml 3,8 ml 200 µl 8 ml 20 µl 200 µl

Sammelgel

Anzahl der Gele	1	2	4
H2O Stacking Buffer SDS 10% Acryl-/Bisacrylamid 30% TEMED APS 10%	1,2 ml 0,5 ml 20 µl 260 µl 2 µl 10 µl	2,4 ml 1 ml 40 µl 520 µl 5 µl 50 µl	4,8 ml 2 ml 80 µl 1040 µl 10 µl 100 µl

2. Elektrophorese

- Westernblottkassette zusammen bauen und Trenngel gießen (mit kleiner Menge Isopropanol überschichten)
- nach ca. 15 min Isopropanol abgießen
- Sammelgel darauf gießen
- Kämme unmittelbar hinzufügen, ca. 15 min fixieren lassen
- in der Zwischenzeit Proben vorbereiten

- x µl Probe plus x µl Sample Buffer
- 3-5 min bei 5°C; anschließend zentrifugieren, auf Eis aufbewahren

- Gele in Elektrophoresekammer einbauen
- 1x Running Buffer (möglichst vorgekühlt) hinzufügen
- Kämme herausziehen
- Proben und Standard(s) laden
- Elektrophorese:

100 V ca. 15-20 min (bis Proben im Trenngel ankommen) RT
150 V ca. 1 h RT

3. Blotten

- Gele in Transfer-Buffer waschen
- Membran zuschneiden 9x6 cm
- Schwämme, Papier, Membran sorgfältig in Transfer-Buffer tränken
- Blotting-Sandwich aufbauen:

- Reihengfolge: Halterung-Schwamm-Papier-Gel-Membran-Papier-Schwamm-Halterung

Achtung: Luftblasen sorgfältig entfernen!

- Sandwich in Kammer einbauen – auf Laufrichtung achten!
- Eisblock einsetzen
- Kammer mit 1x Transfer-Buffer füllen
- Transfer:

100 V 1h RT bzw. 50 V 2h
10 V über Nacht

4. Blocken

- Membran 3x waschen (in TTBS)
- in 2,5-5% BSA in TTBS (alternativ in Blocking Milk) 1h RT/37°C blockieren
- 3x 10 min waschen in TTBS

5. Primärer Antikörper

- Verdünnung in TTBS z.B. 1:1000
- über Nacht 4°C oder für wenige Stunden bei RT (gemäß Datenblatt)
- Antikörper auffangen und bei 4°C lagern

6. Sekundärer Antikörper

- gründlich in TTBS waschen (mind. 3x)
- Verdünnung in TTBS z.B. 1:5000
- 1,5-2h bei RT
- gründlich in TTBS waschen, 2h

7. Entwickeln mit ECL

- Membran auf Folie legen
- 500 µl Lösung A + 500 µl Lösung B zusammenpipettieren

- mischen
- auf Membran tröpfeln
- kurz einwirken lassen
- gut ablaufen lassen

- in Dunkelkammer Film auflegen und entwickeln