Intrazelluläre Färbung von Markern mit Flurochrom-konjugierten Antikörpern

Intrazelluläre Färbungen gestalten sich etwas aufwändiger als die Färbung von Oberflächenmarkern. Neben den üblichen Färbeschritten (Färben, Waschen) müssen die Zellen für eine intrazelluläre Färbung fixiert und permeabilisiert werden.

1) Zellen ernten und waschen:

Zählen sie die Zellen in einem Hämozytometer und stellen Sie die Zelldichte mit eiskaltem PBS (oder PBS mit 10% FCS und 1% Natriumazid) auf 1 - 5 x 106 /ml ein.
Die Zellen werden normalerweise in 12 x 75 mm Rundboden-Polystyrolröhrchen (FACS-Röhrchen) gefärbt, die anschließend direkt für die Messung eingesetzt werden können.

2) Zellen vorlegen:

Legen Sie die gewünschte Anzahl an Zellen in einem kleinen Volumen in den Röhrchen vor (z.B. 150µl für 150000 Zellen pro Ansatz bei 1 x 106 Zellen/ml).

3) Fixierung:

Geben Sie in jedes Röhrchen 100µl des Fixierungsmittels (z.B. 4% Paraformaldehyd) und lassen Sie den Ansatz 15 min bei 4°C inkubieren. Waschen Sie die Suspension anschließend in PBS mit 0,2% Tween 20 (ca. 5min bei 400g).

4) Permeabilisierung:

Geben Sie in jedes Röhrchen 100µl der Permeabilisierungslösung (z.B. 0,2% Saponin oder 0,2% Digitonin) und inkubieren Sie die Suspension für 15 min bei 4°C. Waschen Sie die Suspension anschließend in PBS mit 0,2% Tween 20 (ca. 5min bei 400g).

5) Blockieren

Blockieren Sie unspezifische Bindungsstellen mit 5% Serum oder BSA. Lassen Sie die Lösung für 15 bis 30 min inkubieren und waschen Sie erneut mit 0,2% Tween 20 in PBS (ca. 5min bei 400g).

6) Antikörper hinzufügen

Geben Sie nun die benötigte Menge Antikörper zu (Vorversuche!) und lassen Sie die Suspension für 15 bis 45 min im Dunkeln bei 4°C inkubieren. Waschen Sie die Zellen mit 0,2% Tween 20 in PBS (ca. 5min bei 400g).

7) Zellen resuspendieren

Resuspendieren Sie die Zellen in 300 bis 500µl kaltem PBS (oder PBS mit 10% FCS und 1% Natriumazid). Lagern Sie die Zellen bei 4°C bis zur Messung (bis zu 24 h). Auch hier erhält man die besten Ergebnisse, wenn die Zellen möglichst schnell nach der Färbung gemessen werden.

Hinweis: Dieses Protokoll ist lediglich eine Empfehlung, die Ihnen das Arbeiten mit unseren Antikörpern erleichtern soll. Eine Garantie für das Erzielen optimaler Ergebnisse auf Basis dieses Protokolls wird nicht abgegeben. In der Regel werden auf dem Datenblatt Verdünnungshinweise angegeben. Für Fragen steht wir Ihnen zudem gern zur Verfügung. »Kontaktinformationen

Hinweis: Auf antikoerper-online.de finden Sie mehr als 40.000 Antikörper für die Durchflusszytometrie (FACS)