Indirekte Färbung von Oberflächenmarkern mit Primärantikörper und Flurochrom-konjugierten Sekundärantikörper

Die indirekte Färbung benötigt zwei Inkubationsschritte: zuerst wird mit dem primären Antikörper inkubiert gefolgt von der Inkubation mit dem Sekundärantikörper. Der Sekundärantikörper bindet selektiv an den Primärantikörper und ist mit einem Flurochrom gekoppelt. Er dient dazu, den Primärantikörper bei der FACS-Messung sichtbar zu machen.

1) Zellen ernten und waschen:

Zählen sie die Zellen in einem Hämozytometer und stellen Sie die Zelldichte mit eiskaltem PBS (oder PBS mit 10% FCS und 1% Natriumazid) auf 1 - 5 x 106 /ml ein.
Die Zellen werden normalerweise in 12 x 75 mm Rundboden-Polystyrolröhrchen (FACS-Röhrchen) gefärbt, die anschließend direkt für die Messung eingesetzt werden können. Alternativ können auch andere Gefäße oder Mikrotiterplatten (Rundboden) eingesetzt werden, je nachdem welche Art von Zentrifuge zur Verfügung steht.

2) Antikörpermenge vorlegen:

Legen Sie die benötigte Menge an Antikörpersuspension (Primärantikörper) in jedem Röhrchen vor und geben Sie die gewünschte Anzahl an Zellen dazu (z.B. 150µl für 150000 Zellen pro Ansatz bei 1 x 106 Zellen/ml).

3) Zellen inkubieren:

Lassen Sie die Zellen für etwa 30 Minuten im Dunkeln inkubieren. Die Inkubation kann entweder bei RT oder bei 4°C erfolgen. Hier sollten Sie die optimalen Bedingungen in Vorversuchen ermitteln.

4) Waschen:

Geben Sie nach der Inkubation 1 ml kaltes PBS (oder PBS mit 10% FCS, 1% Natriumazid) zu und zentrifugieren Sie die Suspension bei ca. 400g für 5 min. Nehmen Sie den Überstand ab und wiederholen Sie den Waschschritt zweimal. (oft reicht auch ein Waschschritt um nicht gebundenen AK zu entfernen. Finden Sie in Vorexperimenten heraus wie viele Waschschritte Sie benötigen um Zeit zu sparen).

5) Sekundärantikörper hinzufügen:

Geben Sie nun den Flurochrom-gekoppelten Sekundärantikörper in der benötigten Menge zu (richten Sie sich nach den Herstellerangaben oder finden Sie die für ihre Zwecke optimale Menge in Vorversuchen heraus (empfohlen)).

6) Zellen inkubieren:

Lassen Sie die Zellen für etwa 20 bis 30 Minuten im Dunkeln inkubieren. Die Inkubation kann bei RT oder bei 4°C erfolgen. Hier sollten Sie die optimalen Bedingungen in Vorversuchen ermitteln.

7) Waschen:

Geben Sie nach der Inkubation 1 ml kaltes PBS (oder PBS mit 10% FCS, 1% Natriumazid) zu und zentrifugieren Sie die Suspension bei ca. 400g für 5 min. Nehmen Sie den Überstand ab und wiederholen Sie den Waschschritt zweimal. Auch hier empfiehlt es sich zu überprüfen ob drei Waschschritte nötig sind.

8) Resuspendieren:

Resuspendieren Sie die gefärbten Zellen in 300 bis 500 µl kaltem PBS (oder PBS mit 10% FCS, 1% Natriumazid) und lagern Sie die Zellen bis zur Messung im Dunkeln auf Eis oder im Kühlschrank. Die besten Ergebnisse erhält man, wenn die Zellen direkt nach der Färbung gemessen werden.
Achten Sie vor jeder Messung darauf, dass die Zellen gut suspendiert sind. Vortexen Sie jedes Röhrchen kurz, bevor sie es ins FACS einsetzten.

Hinweis: Dieses Protokoll ist lediglich eine Empfehlung, die Ihnen das Arbeiten mit unseren Antikörpern erleichtern soll. Eine Garantie für das Erzielen optimaler Ergebnisse auf Basis dieses Protokolls wird nicht abgegeben. In der Regel werden auf dem Datenblatt Verdünnungshinweise angegeben. Für Fragen steht wir Ihnen zudem gern zur Verfügung. »Kontaktinformationen

Hinweis: Auf antikoerper-online.de finden Sie mehr als 40.000 Antikörper für die Durchflusszytometrie (FACS)