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Durchflusszytometrie (FACS): Messprinzip & Aufbau

Die Durchflusszytometrie (FACS) ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Oberflächenmolekülen und intrazellulären Proteinen, Peptiden und DNA. Das Prinzip ist eine Antigen-Antikörper-Reaktion, die mit Fluoreszenzfarbstoff-markierten spezifischen Antikörpern durchgeführt wird. Zur Quantifizierung von DNA werden interkalierende Farbstoffe (ohne Antikörper) eingesetzt.

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Bei dem Begriff handelt es sich um eine Abkürzung für . Obwohl der Begriff ein Markenname der Firma Becton Dickinson (BD) ist, hat er sich als Synonym für die eingebürgert. Geräte und Zubehör für die werden auch unter anderen Namen von diversen Herstellern angeboten.

Grundlage einer ist eine (gefärbte) Einzelzellsuspension, die einzeln einen fokussierten Laserstrahl passiert. Das dabei erzeugte Streu- und Fluoreszenzlicht wird separat detektiert. Bei der Messung werden die Zellen durch eine Kapillare gesaugt und gelangen einzeln in die , in der sie durch Laserlicht angeregt werden. Detektiert wird zum einen die Lichtstreuung, zum anderen das emittierte Fluoreszenzlicht der Antikörper-gekoppelten Fluorophore.

LICHTSTREUUNG

Die Zellen streuen einen Teil des Lichts, welches mittels Detektoren (Photomultiplier) nachgewiesen wird. Die Menge des gestreuten Lichts korreliert mit der Größe der Zelle und mit ihrer Komplexität. So streuen , die eine raue Oberfläche und in ihrem Inneren viele Vesikel haben, deutlich mehr Licht als die sehr glatten B- oder T-Zellen. Das Vorwärtsstreulicht (FSC = Forward Scatter) ist ein Maß für die Beugung des Lichts im flachen Winkel und hängt vom Volumen der Zelle ab. Das Seitwärtsstreulicht (SSC = Sidewards Scatter) ist ein Maß für die Brechung des Lichts im rechten Winkel, die von der Granularität der Zelle, der Größe und Struktur ihres Zellkerns und der Menge der Vesikel in einer Zelle beeinflusst wird. Mit diesen beiden Parametern lassen sich zum Beispiel die Zellen des Blutes bereits ungefärbt recht gut unterscheiden (Abb. 1).

Charakterisierung von ungefärbten Zellen anhand der Lichtstreuung (Dot Plot)

Abb 1: Charakterisierung von ungefärbten Zellen anhand der Lichtstreuung (Dot Plot). Große Zellen befinden sich rechts in der Abbildung. Granuläre Zellen befinden sich oben. Große Zellen mit hoher Granularität (z.B. ) sind demnach rechts oben zu finden, während kleinere, glatte Zellen links unten angezeigt werden.

FLUORESZENZMESSUNGEN

Gleichzeitig mit dem gestreuten Licht kann man im Fluoreszenzfarben messen. Nur wenige Zellen emittieren per se fluoreszierendes Licht. Daher verwendet man Farbstoffe, die an bestimmte Bestandteile der Zellen binden. Setzt man z.B. die Farbstoffe DAPI und Propidiumiodid ein, welche in die DNA einer Zelle interkalieren (d.h. sich zwischen die Basen einlagern), so kann man anhand der Helligkeit der Zelle untersuchen, wieviel DNA sie enthält. Auch Antikörper, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, können verwendet werden. Die Antikörper sind meist gegen bestimmte (z.B. Proteine der ; CD = ) gerichtet. Durch Einsatz von verschiedenfarbigen Lasern und vor allem Filtern kann die Anzahl der einsetzbaren Farbstoffe pro Messung und damit die Informationsdichte erhöht werden. Es ist möglich, in einer Messung verschiedene Marker zu detektieren, sofern sich die Wellenlängen des emittierten Fluoreszenzlichts der eingesetzten Fluorophore unterscheiden (Mehrfachfärbungen).

Schematische Darstellung von gefärbten Zellen bei der FACS-Messung

Abb 2: Schematische Darstellung von gefärbten Zellen bei der FACS-Messung. Das erste Bild zeigt eine Zelle die positiv und negativ ist. Das Antikörper-gekoppelte Fluorochrom wird durch den Laser angeregt und emittiert Fluoreszenzlicht einer bestimmten Wellenlänge (Rot). Das Licht wird im Fluoreszenzkanal 1 gemessen. Das zweite Bild zeigt eine negative und positive Zelle. Hier sendet ein anderes Fluorochrom Licht einer anderen Wellenlänge (Grün) aus, welches in Kanal 2 gemessen wird.

Die erhaltenen Messergebnisse werden anschließend mit der Gerätesoftware grafisch dargestellt. Die Art der Darstellung wird vom Benutzer festgelegt. In der Regel wählt man eine Darstellung als Dot Plot und als Histogramm. Die oben dargestellten Färbungen könnten nach der Messung folgendermaßen aussehen:

DOT PLOT

Schematische Darstellung von gefärbten Zellen bei der FACS-Messung

Abb. 3: Schematische Darstellung eines Dot Plots für CD14 und CD80. Zellen, die für beide Marker negativ sind, befinden sich unten links. positive Zellen sind unten rechts und positive Zellen oben links. Im oberen rechten Teil der Abbildungen sind Zellen, die für beide Marker positiv sind. Die Fluoreszenzintensität nimmt von links nach rechts (x-Achse) bzw. von unten nach oben (y-Achse) zu.

HISTOGRAMM

Die beiden Histogramme zeigen die Ergebnisse für die Oberflächenmarker  CD14 (a) und CD80 (b) einzeln

Die beiden Histogramme zeigen die Ergebnisse für die Oberflächenmarker  CD14 (a) und CD80 (b) einzeln

Abb. 4: Die beiden Histogramme zeigen die Ergebnisse für die Oberflächenmarker (a) und (b) einzeln. Die X-Achse gibt hier die Fluoreszenzintensität wieder, die y-Achse die Zellzahl. Der Balken gibt den Anteil positiver Zellen wieder.

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