Immunhistochemie (IHC)

Immunhistochemie (IHC) ist eine Methode, die das Detektieren von Antigenen in Gewebeschnitten ermöglicht. Die Schnitte werden zu diesem Zweck Antikörpern ausgesetzt, die spezifische Epitope im Gewebe erkennen. Mit Hilfe eines Markers, der an einen Antikörper gebunden ist, kann das Epitop sichtbar gemacht werden. Zur Verfügung stehen fluoreszierende Marker, Enzyme, Radioaktivität oder kolloidales Gold. Es gibt zwei Methoden zur Detektion, die sogenannte direkte Methode, bei der ein markierter Antikörper das Antigen bindet und detektiert wird, sowie die indirekte Methode, bei welcher ein nicht markierter Antikörper das Antigen bindet und von einem zweiten, markierten Antikörper, gebunden wird, der zur Detektion dient.


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PRÄPARATION DES GEWEBES

Die Präparation der Gewebeproben ist von größter Wichtigkeit, da schlechte Handhabung zur Beschädigung des Gewebes führen kann, die die Bindungsaffinität der Antikörper herabsetzt oder das Binden sogar völlig unmöglich macht. Das erklärte Ziel ist die nahezu lebensechte Bewahrung des Gewebes sowie das Verhindern von Befall durch Pilze oder Bakterien. Fixierungsmittel, wie beispielsweise Paraformaldehyd-Lysin-Perjodat (PLP) oder Formalin, erfüllen diese Aufgabe. Eines der am häufigsten verwendeten Fixierungsmittel besteht aus 4%-10% (manchmal bis zu 40%) Formaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (zur pH Stabilisierung).

Gewebe, die Formaldehydbehandlung nicht tolerieren, können in flüssigem Stickstoff schockgefroren werden, um Gewebeschnitte anzufertigen. Fixierte Gewebe werden, nachdem sie mit Alkohol (z.B. Ethanol oder Isopropanol) dehydriert wurden beispielsweise in eine Paraffinmatrix eingebettet, um Gewebeschnitte anfertigen zu können. Empfindliche Gewebe werden vorzugsweise mit einem Vibratom-Mikrotom bearbeitet, um die physikalische Beanspruchung zu minimieren.

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ANTIGENDEMASKIERUNG

Obwohl formalinfixierte, paraffin-eingebettete Proben eine hohe Qualität in Bezug auf die Bewahrung morphologischer Strukturen gewährleisten, sind Änderungen der Struktur des Antigens möglich, die bis zum Verlust der Immunreaktivität führen können. Die Präsentation des Antigens und damit seine Reaktivität, können jedoch verbessert oder sogar wiederhergestellt werden. Es gibt hauptsächlich zwei Methoden, die dazu genutzt werden: Zum einen Hitzebehandlung (sog. "heat induced epitope retrival" (HIER)), zum anderen eine proteolytische Behandlung (sog. "proteolytic induced epitope retrieval" (PIER)). Vor der Anwendung dieser Methoden muss das Paraffin entfernt werden und die Proben müssen dehydriert werden.

HIER funktioniert mit Hilfe eines vorgewärmten Puffers. Die Zusammensetzung und der pH-Wert dieses Puffer variieren, aber meistens werden Tris-HCl oder Citrat basierte Puffer verwendet. Die eingetauchte Probe wird zumeist zwischen 10 und 60 Minuten inkubiert und dann langsam abgekühlt. Die Wärmebehandlung kann im Autoklaven, Wasserbad, Dampfkochtopf oder ähnlichem durchgeführt werden..

PIER funktioniert durch den Einsatz Proteine verdauender Enzyme, wie z.B. Proteinase K, Trypsin, Pepsin und einer Reihe anderer Proteinasen. Die optimalen Inkubationsbedingungen sowie die am besten funktionierenden Konzentrationen müssen durch Tests heraus gefunden werden. Manchmal ist es notwendig, HIER und PIER zu kombinieren, um die optimale Demaskierung zu erreichen.

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FÄRBEMETHODEN

Direkte Methode

Bei dieser Methode bindet ein markierter Antikörper (z.B. mit einem Substrat und Chromogen) an das Antigen im Zielgewebe. Der Vorteil dabei ist, dass man lediglich einen Antikörper braucht, was die Durchführung beschleunigt und nur wenig unspezifische Bindungen erzeugt. Auf der anderen Seite ist die Intensität des Signals zu gering für die Anwendung bei Proben mit wenigen Antigenen.

Indirekte Methode (zweistufige)

Die indirekte Methode wurde entwickelt, um die Signalintensität zu verbessern. Hierbei bindet der primäre Antikörper das Antigen, woraufhin der sekundäre Antikörper (welcher markiert ist) den ersten Antikörper bindet. Diese Methode erlaubt eine Signalverstärkung, da mehrere sekundäre Antikörper an einen primären Antikörper binden können. Ein weiterer Vorteil kann sein, dass man lediglich einen markierten Antikörper benötigt, um eine Vielzahl an verschiedenartigen Experimenten durchzuführen, was die Kosten verringern kann. Ein Nachteil ist, dass unspezifisches Binden zunimmt, was Hintergrundsignale verstärkt.

Dreistufige Methode

Eine weitere Verstärkung des Signals kann erreicht werden, indem ein dritter (markierter) Antikörper verwendet wird, der den sekundären Antikörper bindet. Bei Proben mit einer kleinen Anzahl an Epitopen ist dies die zu empfehlende Methode.

PAP Methode

Die Peroxidase anti-Peroxidase Methode wird heute seltener genutzt, war aber früher in pathologischen Anwendungen die Methode erster Wahl. PAP ist eine indirekte Methode, die darauf basiert, dass ein Perioxidase bindender Antikörper an einen sekundären Antikörper gebunden ist. Das heißt, dass dieser Antikörper spezifisch für Peroxidase sein muss. Die Peroxidase ist also nicht auf chemische Art an das IgG konjugiert, sondern immunologisch gebunden. Der Vorteil dieser Vorgehensweise ist, dass die Peroxidase Aktivität und damit auch die Signalstärke, größer ist. Die Empfindlichkeit ist auf diese Weise um das Hundert- bis Tausendfache erhöht.

(Strept)Avidin-Biotin Complex (ABC) Methode

Die heute am häufigsten genutzten Methoden beruhen auf der Verwendung von Avidin (aus Hühnereiern) und Streptavidin (Streptomyces avidinii), dass eine hohe Affinität für das Glycoprotein Biotin besitzt. Das generelle Prinzip beruht darauf, dass Avidin (oder Streptavidin) einen biotinylierten sekundären Antikörper bindet, der eine Meeretischperoxidasereaktion katalysiert.

Manchmal wird eine catalyzed signal amplification (CSA) (katalysierte Signalamplifikation) eingesetzt. Dabei wird ein Amplifikationsreagenz eingesetzt, welche zur Aggregation vieler Biotinmoleküle führt, die anschließend mit Streptavidin markierter Peroxidase reagieren. Ein Problem bei der Verwendung von Avidin ist seine hohe elektrostatische Bindung, die auf der großen molekularen Ladung beruht. Streptavidin besitzt diese problematische Eigenschaft nicht und seine Verwendung verringert daher das Hintergrundsignal.

Methoden mit Einsatz von Polymeren

Polymere, die durchschnittlich zehn Antikörper und ungefähr 70 Enzymmoleküle binden können, werden eingesetzt, um eine Amplifikation des Signals zu erreichen. Die daraus resultierende erhöhte Empfindlichkeit beruht auf einer Reduktion der unspezifischen Bindungen und führt daher zu einem schwächeren Hintergrundsignal. Zudem erlaubt diese Methode eine Doppelfärbung zwei verschiedener Antigene gleichzeitig.

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