Radioimmunoassay (RIA)

Radioimmunoassay (RIA) ist eine Methode, die die Menge eines Antigens in einer Probe mit hoher Empfindlichkeit messen kann. Prinzipiell kann jede biologische Substanz gemessen werden, für die es einen spezifischen Antikörper gibt. RIA war die erste immunologische Methode, die die Erfassung von nano- und pico molaren Konzentrationen von Hormonen in biologischen Flüssigkeiten ermöglichte. Um dies zu erreichen, wird ein Antigen radioaktiv markiert und an seinen spezifischen Antikörper gebunden (von dem eine definierte Menge zugegeben wird). Bei der Zugabe einer Probe, wie beispielsweise eines Blutserums, findet eine kompetitive Reaktion statt. Durch den Wettbewerb der markierten mit den unmarkierten Antigenen wird eine bestimmte Menge von markierten Antigenen frei. Diese Menge ist proportional zu dem vorhandenen Verhältnis von markierten zu unmarkierten Antigenen.

Je größer die Menge der unmarkierten Antigene wird, desto größer ist die Menge der markierten Antigene, die ihre Bindung lösen. Aufgrund dessen ist es möglich, nach einer Trennung der gebundenen von den ungebundenen Antigenen, die Menge der ungebundenen, radioaktiven Antigene im Überstand zu messen. Nach der Erstellung einer Standardkurve, mit Proben bekannter Konzentration, kann mittels der gemessenen Radioaktivität auf die Menge unbekannten Antigens geschlossen werden.

Obwohl das Radioimmunoassay eine alte Methode ist, ist sie noch weit verbreitet, vor allem, da sie den Vorteil hat einfach durchführbar zu sein und, wie erwähnt, sehr empfindlich zu sein.

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Radioimmunoassay: Erforderliche Substanzen und Ausrüstung

• 1. Spezifisches Antiserum gegen das Antigen das gemessen werden soll.
• 2. Verfügbarkeit des radioaktiv markierten Antigens.
• 3. Eine Methode, mit derer man die markierten gebundenen Antigene von den markierten ungebundenen trennen kann.
• 4. Geräte zur Messung von Radioaktivität

Radioaktivität

125-I isotope, manchmal aber auch C14 und H3 werden zur Markierung von Antigenen verwendet. Radioaktive Markierungen werden für gewöhnlich erreicht, indem man Antigene an Tyrosin Resten mittels einer Chloramin-T oder Peroxidase Methode jodiert (125-I) und anschließend, mittels Gelfiltration oder HPLC, von freien Isotopen reinigt. Andere Wichtige Ingredienzien für die RIA sind spezifische Antikörper und das ursprüngliche Antigen für die Standardkurve (zur Kalibrierung).

Separationstechniken

Doppelantikörper-, Kohle-, Zellulose-, Chromatographie- oder Festphasentechniken werden angewandt, um gebundenes und freies radiomarkiertes Antigen zu trennen. Am häufigsten wird die Doppelantikörpertechnik in Kombination mit Polyethylen verwendet. Die gebundene oder freie Fraktion wird in einem Gammazähler gezählt.

Gleichzeitig wird eine Kalibrierungs- oder Standardkurve mit Proben bekannter Konzentrationen der unmarkierten Standards erstellt. Aus dieser Kurve kann die Antigenmenge in einer unbekannten Probe berechnet werden.

Empfindlichkeit

Die Empfindlichkeit der Methode kann dadurch verbessert werden, dass man die Menge des radioaktiv-markierten Antigens reduziert und /oder durch Reduktion der Antikörpermenge. Zudem kann man die Empfindlichkeit steigern, indem man durch Zugabe von radioaktiv markiertem Antigen, nach der Initialen Inkubation von Antigen und Antikörper, ein Ungleichgewicht der Bindungspartner erzeugt.

Troubleshooting

Der Antikörper sollte möglichst spezifisch für das zu untersuchende Antigen sein und keine Kreuzreaktionen eingehen. Im Falle von Kreuzreaktionen sollte der Antikörper ausgetauscht werden, oder, wenn nicht möglich, eine Aufreinigung von unspezifisch reagierenden Antikörpern mittels Affinitätschromatographie durchgeführt werden.

Ausgewählte Antikörper, validiert für RIA

Referenzen

• Patrono, C. and Peskar, B.A. (eds) Radioimmunoassay in basic and clinical pharmacology. Heidelberg, Springer-Verlag, 1987.