Monoklonale Antikörper

Monoklonale Antikörper sind immer gegen ein einziges Epitop gerichtet, da sie ursprünglich von nur einer B-Zelle hergestellt werden. Wie auch für polyklonale Antikörper muss ein Wirt mit dem spezifischen Antigen immunisiert werden, um die Antiköper-produzierende Zelle zu gewinnen (siehe Abbildung 1 Schritt 1 und 2). Diese Zelle wird dann mit einer Tumorzelle des Wirtsorganismus fusioniert (siehe Abbildung 1 Schritt 4).

1975 publizierten G. Köhler und C. Milstein in Nature die Einführung einer Hybridom Technik zur Herstellung monoklonaler Antikörper.1 Diese wurde zur einer der wichtigsten Säulen in der modernen biologischen Forschung, sowie der Diagnose und Therapie verschiedener Erkrankungen. Die Autoren fusionierten eine Myelom-Zelle der Maus mit einer Milzzelle der Maus (Beide aus dem BALB/c Hintergrund) und erhielten damit eine Reihe von Zelllinien, die Antikörper gegen rote Blutzellen des Schafes sezernierten (siehe Abbildung 1 Schritt 4 und 5). Als Resultat wurden monoklonale Antikörper stabil in einer Hybridzelle exprimiert, die auch Hybridom genannt wird. Die Hybridom-Zellen konnten dann entweder in eine BALB/c Maus injiziert werden, um dadurch antigen-spezifisches Serum zu erhalten, oder mit weiteren antikörper-produzierenden Zellen unterschiedlichen Ursprungs hybridisert werden, um so in vitro Antikörper herzustellen. Georges Köhler, César Milstein und Niels Kaj Jerne erhielten 1984 für diese Entdeckungen und darauf folgenden Arbeiten den Nobelpreis für Medizin.

Prinzip der Hybridoma-Technik

Abbildung 1: Prinzip der Hybridoma-Technik Erstellt von Martin Brändli (Own work) [CC-BY-SA-2.5 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/2.5)], via Wikimedia Commons

Hybridom-Zellen synthetisieren den spezifischen monoklonalen Antikörper der ursprünglich von der B-Zelle produziert wurde. Die ursprüngliche B-Zelle produzierte monoklonale Antikörper abhängig von dem kurz zuvor in den Wirt injizierten Antigen. Einen feinen Unterschied gibt es, wenn kurz zuvor Viren injiziert wurden, die sich erst im Wirt vermehren müssen, um schließlich eine Antikörper-produzierende Immunantwort zu erzeugen. Danach ergibt auch hier die Fusion mit einer Tumorzelle ein Hybridom, das monoklonale Antikörper gegen den spezifischen Virus bildet.

Hybridom-Zellen werden durch ihre Epitop Affinität selektioniert und danach durch weitere Kultivierung in Selektions-Medium mit Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin (HAT Medium). Aminopterin blockiert die de novo Synthese der DNA, wodurch die Zellteilung unterbunden wird. Hypoxanthin und Thymidin versorgen die Zellen mit den nötigen Substanzen die Blockade zu umgehen, wenn sie die nötigen funktionierenden Enzyme besitzen. Nicht-fusionierte Myelom-Zellen produzieren jedoch nicht die funktionellen Enzyme und die nicht-fusionierte Milzzellen haben keine unendliche Teilungsfähigkeit. Dadurch überleben nur die Hybridom-Zellen im HAT-Medium.2

Wie zuvor beschrieben gibt es zwei Methoden, um die Hybridom-Zellen wachsen zu lassen (hier im Detail nur für Mäuse als Wirt beschrieben): 1) sie können in den Bauchraum einer Maus injiziert werden (siehe Abbildung 1 Schritt 7b), oder 2) es können in vitro Zellkultur-Verfahren zur Anwendung kommen (siehe Abbildung 1 Schritt 7a). Die Zellkultur Verfahren bedürfen einiger Erfahrung und brauchen bestimmte Medien. Dies kann sehr teuer und aufwendig werden. Obwohl die in vitro Produktion monoklonaler Antikörper das hauptsächlich verwendete

Verfahren ist, werden einige monoklonale Antikörper auch weiterhin in vivo in Mäusen produziert. Nach der Injektion der Hybridom-Zellen in die Maus, vermehren sich die Zellen, bilden einen Tumor und geben ein Sekret (engl. ascites) in den Bauchraum ab. Dieses Sekret enthält den Antikörper in einer hohen Konzentration (zum Teil in 10-fach höherer Konzentration als im Überstand der Zellkulturen).2 Das „The Institutional Animal Care And Use Committee (IACUC)“ hat eine Leitfaden rausgegeben, wann die in vivo Produktion von Antikörpern vertretbar ist.3

Monoklonale Antikörper werden heute sehr häufig in der Forschung, Diagnostik und Therapie eingesetzt. Ein Manko der häufig genutzten Antikörper aus Mäusen in der Therapie-Anwendung beim Menschen ist die ungewollte Immunantwort, die auf Grund geringer struktureller Unterschiede zwischen humanen und murinen Antikörpern auftritt. 1988 bereiteten Greg Winter und sein Team den Weg für eine Technik die Antikörper zu „vermenschlichen“. Dadurch konnten die Nebenwirkungen bei vielen Patienten verringert werden.4 Bei einer häufig verwendeten Methode wird Mäuse-DNA, die die Bindungsregion des Antikörpers kodiert, mit menschlicher DNA, die für Antikörper kodiert, verbunden und in lebende Zellen überführt. Dies ergibt teilweise murine, teilweise humane Antikörper.5 Diese Art der Antikörper wird auch Chimär bzw. chimäre Antikörper genannt. Heutzutage können chimäre Antikörper aus einer Vielzahl verschiedener Wirte erstellt werden.

Viele Proteine, die bei der Signalverarbeitung oder bei Erkrankungen eine wichtige Rolle spielen, sind stark konserviert in Mäusen, Ratten und Menschen. Sie können daher vom Wirt (Maus oder Ratte) als Eigen-Antigen erkannt werden und weniger stark immunogen wirken. Um diese Einschränkung der Antigen Erkennung zu umgehen, wurden Hybridom-Zellen vieler verschiedener Wirte erzeugt. Andererseits können Antigene aus Pflanzen zu einer ähnlichen Beschränkung führen, wenn ein Herbivor als Wirt genutzt wird. Hier kann es hilfreich sein einen Omnivor oder Karnivor als Wirt zu verwenden.

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Quellen:

1 Köhler, G. & Milstein, C. (1975): Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. In: Nature. Bd. 256, S. 495–497. PMID 1172191. doi:10.1038/256495a0, Nachdruck in: J. Immunol. Bd. 174, S. 2453–2455. PMID 15728446

2 Monoclonal Antibody Production; National Research Council (US) Committee on Methods of Producing Monoclonal Antibodies. Washington (DC): National Academies Press (US); 1999. ISBN-10: 0-309-07511-4 ISBN-13: 978-0-309-07511-4 ISBN-10: 0-309-51904-7, Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK100200/

3 http://iacuc.utk.edu/policies-and-procedures/guidelines-for-in-vivo-monoclonal-antibody-production/

4 Riechmann L, Clark M, Waldmann H, Winter G (March 1988). "Reshaping human antibodies for therapy". Nature 332 (6162): 323–327. Bibcode:1988Natur.332..323R. doi:10.1038/332323a0. PMID 3127726.

5 Chadd HE, Chamow SM (April 2001). "Therapeutic antibody expression technology". Curr. Opin. Biotechnol. 12 (2): 188–94.doi:10.1016/S0958-1669(00)00198-1. PMID 11287236